組蛋白去乙酰化酶抑制劑對腦膠質瘤干細胞的作用及其機制▲

冀保衛 陳麗華 陳治標 蔡 強

(武漢大學人民醫院1 神經外科，2 麻醉科，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：jbw2002@whu.edu.cn)

腦膠質瘤是中樞神經系統常見的惡性腫瘤，發病率高，約占成人原發顱內腫瘤的80%。目前臨床上多采用以手術為主的綜合方法治療腦膠質瘤，但其預后仍較差，死亡率高[1-2]。近年來，腫瘤干細胞的發現為腫瘤的治療帶來曙光，目前已在多種腫瘤內發現干細胞的存在[3-5]。已有研究證實膠質瘤干細胞較普通膠質瘤細胞具有更強的耐藥性，是腫瘤復發的主要原因，但目前尚無可靠方法有效殺傷體內膠質瘤干細胞[6-8]。因此，探索針對膠質瘤干細胞的靶向治療方法意義重大。組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275是近年來發現的對多種腫瘤細胞具有較好治療作用的新型抗腫瘤藥物[9]，已被證實能顯著抑制膠質瘤細胞的增殖，并誘導其凋亡[10]。本研究探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275對膠質瘤干細胞的作用及其機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 膠質瘤母細胞標本來源于2017年1月至2017年12月武漢大學人民醫院神經外科收治的22例腦膠質瘤患者術中切除的腫瘤組織。其中男性12例，女性10例，年齡(56±2)歲，納入標本均經病理證實為膠質瘤母細胞，排除病理性質不明確的標本。獲取標本前已獲得患者及家屬同意。本研究獲得武漢大學人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)/F12培養基(批號：11320-033)購自HyClone公司，特優級胎牛血清(fatal bovine serum，FBS；批號：12483-020)、B27添加劑(批號：17504044)均購自Invitrogen公司，堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF；批號：100-18B)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF；批號：100-47)均購自PeproTech公司，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF；批號：GF342)購自Millipore公司，MS-275(批號：S1053)購自Selleck公司，細胞計數(cell counting kit-8；CCK-8，批號：CK04)試劑盒購自Dojindo公司，藻紅蛋白標記小鼠抗人CD133單抗(批號：130-111-079)購自Miltenyi公司，抗人細胞周期蛋白(Cyclin)D1單抗(批號：2922S)購自Cell Signaling公司，兔源多抗(批號：sc-358919)購自Santa Cruz公司，碘化丙啶(批號：ST512)、核糖核酸酶(批號：ST576)、細胞裂解液(批號：P0013)、免疫印跡試驗凝膠電泳試劑盒(批號：P0012A)購自碧云天公司。

1.3 膠質瘤干細胞的分離培養及分組 參照文獻[11]的方法分離、培養腦膠質瘤干細胞：將新鮮腦膠質母細胞瘤組織剪成大小約1 mm3的組織塊，應用胰蛋白酶消化分解，無菌生理鹽水清洗后獲得膠質瘤母細胞；將細胞置于無血清DMEM/F12培養基(含LIF 10 ng/ml，EGF 20 ng/ml，bFGF 20 ng/ml，B27 20 μl/ml)中于37℃、5% CO2、95%濕度培養箱培養約1周，即可獲得膠質瘤干細胞球；將細胞球吹散稀釋后再培養傳代，傳代后仍在無血清DMEM/F12培養基于37℃、5% CO2、95%濕度的培養箱中培養，收集第4代細胞進行后續實驗。成功分離出膠質瘤干細胞后將其分為實驗組與對照組。

1.4 檢測方法

1.4.1 CCK-8法檢測細胞增殖情況：將對數生長期膠質瘤干細胞吹打成單細胞懸液，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)調整細胞濃度，使用細胞計數板計數單位體積懸液內細胞數，調整細胞終濃度為1×104個/ml，接種于96孔板中，200 μl/孔，實驗組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對照組每孔加入等體積PBS。將細胞置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養箱培養48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃避光孵育1 h，用酶標儀檢測實驗組和對照組中各孔吸光度(A值)，依據如下公式計算增殖抑制率：抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。每組設置10復孔。增殖抑制率=0表示藥物無作用，增殖抑制率<0表示藥物可促進細胞增殖，增殖抑制率>0表示藥物抑制細胞增殖。

1.4.2 單克隆法檢測單克隆形成率：將對數生長期膠質瘤干細胞吹打成單細胞懸液，使用PBS調整細胞濃度，使用細胞計數板計數單位體積懸液內細胞數，調整細胞終濃度為0.5×103個/ml，接種于96孔板中，每孔200 μl，實驗組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對照組每孔加入等體積PBS。觀察并計數只有1個細胞的孔，然后置于無血清DMEM/F12培養基中于37℃，5% CO2，95%濕度的培養箱培養1周后計數形成細胞球的孔數，與培養開始時單個細胞孔總數的比值，即為克隆形成率。重復測定5次，取平均值。克隆形成率下降代表具備干細胞特性的細胞比例下降。

1.4.3 流式細胞儀檢測CD133+細胞含量：將對數生長期腫瘤干細胞均勻懸浮于含MS-275的無血清DMEM/F12培養基中，按照2×105個/孔的密度接種細胞于6孔板中，兩組各3孔，實驗組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對照組每孔加入等體積PBS，置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養箱培養72 h，PBS洗滌3次，調整細胞濃度約1×106個細胞/100 μl，加入藻紅蛋白標記的CD133試劑5 μl/100 μl，避光4℃孵育30 min，稀釋至細胞濃度為約5×105個細胞/ml，采用貝克曼公司XL型流式細胞儀檢測CD133+細胞含量。

1.4.4 流式細胞儀檢測細胞周期：將對數生長期膠質瘤干細胞按照2×105個/孔的密度接種細胞于6孔板中，實驗組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對照組每孔加入等體積PBS后于37℃、5% CO2、95%濕度下孵育48 h， PBS洗滌1次，加入碘化丙啶和核糖核酸酶，室溫下避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期變化。細胞周期分為G0/G1、S、G2/M3期。

1.4.5 免疫印跡試驗法檢測Cyclin D1蛋白相對表達量：將對數生長期膠質瘤干細胞按照2×105個/孔的密度接種細胞于6孔板中，實驗組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對照組每孔加入等體積PBS后于37℃、5% CO2、95%濕度下孵育48 h，收集細胞，加入300 μl細胞裂解液，4℃下孵育30 min，收集裂解物，4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清，二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。按50 μg/孔上樣，行常規變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶室溫下封閉2 h，一抗封閉4℃過夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入按1 ∶6 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，電化學發光液室溫孵育約30 s，避光顯影于X線膠片，實驗重復3次。使用QuantityOne Basic軟件計算免疫印跡蛋白條帶灰度值，以肌動蛋白作為參照，獲得兩組相對灰度值，即為兩組Cyclin D1蛋白相對表達量。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料用(x±s)表示，比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組膠質瘤干細胞增殖能力的比較 實驗組A值為(0.790±0.212)，低于對照組的(1.102±0.620)(t=2.402，P=0.042)，細胞增殖抑制率為(28.30±0.72)%。

2.2 兩組腦膠質瘤干細胞單克隆形成率比較 實驗組克隆形成率為(32.284±0.011)%，低于對照組的(87.261±0.002)%(t=4.592，P=0.009)。

2.3 兩組腦膠質瘤干細胞CD133+細胞含量比較 實驗組CD133+細胞含量為(29.485±1.106)%，低于對照組的(89.210±1.120)%(t=10.320，P=0.001)。

2.4 兩組各細胞周期細胞比例比較 實驗組G0/G1期細胞比例高于對照組，S期細胞比例低于對照組(均P<0.05)，兩組G2/M期細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組各細胞周期細胞比例比較(x±s，%)

2.5 兩組腦膠質瘤干細胞Cyclin D1蛋白相對表達量比較 實驗組Cyclin D1蛋白相對表達量為(0.426±0.325)，低于對照組的(0.561±0.234)(t=3.273，P=0.048)，見圖1。

圖1 兩組腦膠質瘤干細胞的Cyclin D1蛋白表達情況

3 討 論

近年來，腦膠質瘤干細胞的發現為腦膠質瘤的治療提供了新的研究方向。腦膠質瘤干細胞是腦膠質瘤的起源細胞之一，如能有效抑制膠質瘤干細胞增殖或促進其死亡，則有望延遲腦膠質瘤的復發，甚至治愈腦膠質瘤。但目前針對腦膠質瘤干細胞進行治療的效果尚不能令人滿意[8]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑被廣泛應用于各種腫瘤的治療研究，其對腦膠質瘤細胞也有一定的治療效果[10]，但對腦膠質瘤干細胞是否具有殺傷作用，目前的研究證據尚不充分，還需要進一步研究。

本研究旨在分析組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275干預后腦膠質瘤干細胞的生物學變化。根據本課題組預實驗研究結果，將MS-275終濃度定位為10 nmol/ml[12]。結果顯示，實驗組細胞增殖抑制率近30%，提示經MS-275干預后，腦膠質瘤干細胞增殖能力明顯降低，生長緩慢，這與MS-275對膠質瘤細胞的作用類似[12]。單克隆性與CD133表達陽性是腦膠質瘤干細胞的主要生物學特性，也是區別于普通膠質瘤細胞的特征，常被用來作為鑒定腦膠質瘤干細胞的指標[13]。本研究結果顯示，實驗組克隆形成率及CD133+細胞含量均低于對照組(均P<0.05)，說明經MS-275干預后，腦膠質瘤干細胞單克隆形成能力下降，細胞不再具有無限增殖能力，體內成瘤的潛在能力下降，并趨向分化。

為探討MS-275抑制腦膠質瘤干細胞增殖的機制，我們對腦膠質瘤干細胞的細胞周期進行檢測。結果顯示，實驗組G0/G1期細胞比例高于對照組(P<0.05)，表明經MS-275干預后，腦膠質瘤干細胞增殖被阻滯于G0/G1期。調節細胞周期的蛋白較多，其中Cyclin D1蛋白主要參與細胞周期G1調控，其主要功能是促進細胞增殖，推動細胞周期由G1時期進入到S時期[14]。研究表明，Cyclin D1是一種原癌基因，其過度表達可導致細胞增殖失控而發生惡變[15]，也可結合組蛋白去乙酰化酶，促進其基因轉錄[16]。本研究中，經MS-275干預后腦膠質瘤干細胞Cyclin D1蛋白表達下降，這可能是導致MS-275干預后腦膠質瘤干細胞的細胞周期停滯于G1期的原因。因此，MS-275抑制腦膠質瘤干細胞增殖的原因可能為：(1)通過下調Cyclin D1蛋白的表達水平，使腦膠質瘤干細胞不能從G1期進入到S期；(2) 抑制腦膠質瘤干細胞內組蛋白去乙酰化酶的部分活性，阻止Cyclin D1與組蛋白去乙酰化酶的結合，從而抑制基因轉錄。

研究表明，組蛋白去乙酰化抑制劑能從多條途徑發揮抗腫瘤作用，如MS-275能使腦膠質瘤細胞侵襲性下降、遷移受阻；通過抑制信號傳導及轉錄激活因子3磷酸化誘導膠質瘤細胞發生凋亡；還可通過抑制IκB-α的磷酸化水平進而抑制核轉錄因子-κB的活性、誘導骨髓瘤細胞U266發生凋亡等[17-20]。MS-275對腦膠質瘤干細胞增殖的抑制作用是否與上述機制有關，還需要進一步研究證實。

綜上所述，組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275能抑制腦膠質瘤干細胞增殖，并促進其分化，其機制可能與MS-275降低腦膠質瘤干細胞Cyclin D1蛋白表達而導致細胞周期受阻滯有關。