生長激素不同刺激方式對肥胖大鼠Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號通路的影響▲

羅燕飛 布力布麗·巴哈提 米熱古麗·買買提 曹 晨 梁 玲

(新疆醫科大學第一附屬醫院兒科，烏魯木齊市 830054，電子郵箱：13669905477@163.com)

生長激素是通過腺垂體分泌的一種肽類激素，在人體中具有重要的生理作用，其通過對骨骼、肌肉、肺臟、肝臟和腎臟等器官的調節進而影響人體各個系統生長、發育和代謝[1-2]。生長激素主要通過兩種機制作用于人體，而這兩種機制都以生長激素與靶細胞膜上的生長激素受體相結合進而激活各自的信號通路。一種機制是與生長激素受體結合后激活Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號轉導及轉錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信號通路，另一種機制是與生長激素受體結合后激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[3]。鑒于生長激素對人體的重要性，本研究分析生長激素不同刺激方式對大鼠JAK/STATS信號通路的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取7日齡的健康Wistar大鼠共78只，其中雄性38只、雌性40只，體重(360.52±6.41)g，均來源于新疆醫科大學動物實驗室，動物生產許可證編號：SCXK(新)2013-0001。用電子天平稱其重量，并測量其身長，計算Lee指數(即肥胖評定指數)，Lee指數=[體重(g)]1/3×1000/體長(cm)。實驗開始前，4組大鼠的體重、Lee指數比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究動物實驗已經通過新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準。

表1 4組大鼠的體重及Lee指數比較(x±s)

1.2 主要實驗試劑及儀器 Benchmark Plus全波長自動酶標儀(上海新振儀器設備有限公司)，BP211D型電子分析天平(美國Sartorius公司)，Milli-Q Biocei型超純水系統(美國Millipore公司)，1-14K型高速低溫離心機(德國Sigma公司)，C1000型PCR儀(美國Bio-Rad公司)，DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)。D12492超高脂飼料(美國Research Diets公司)，磷酸緩沖鹽溶液(美國Invitrogen公司)，重組人生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH；長春金賽藥業有限責任公司生產，批準文號：S20000001)，RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex TaqⅢ試劑盒(TaKaRa公司生產，DRR041A)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 肥胖大鼠模型的建立 將大鼠按照增脂飲食飼養1周，飼養條件為無特定病原體級，室溫20℃～22℃，自然光線，自由飲水進食7 d后采用D12492超高脂飼料(59.9%脂肪、20%蛋白質、20.1%碳水化合物)喂養4周，使其體重達320～350 g，即模型建立成功。最終共獲得60只飲食誘導的肥胖大鼠，建模成功率為76.92%(60/78)。

1.4 分組及干預方法 采用隨機數字表法將肥胖模型大鼠分為A、B、C、D組，每組15只，分別給予磷酸緩沖鹽溶液2 ml/d、rhGH 0.1 IU/(g·d)、rhGH 0.2 IU/(g·d)、rhGH 0.3 IU/(g·d)肌肉注射，1次/d，同等條件下飼養，2周后處死，其中每組采用隨機數字表法選取7只在處死前30 min注射1 IU/g的rhGH。

1.5 標本的獲取 10%水合氯醛麻醉大鼠后解剖其腹腔，取出肝臟、腎臟周圍和皮下周圍的部分脂肪，用濾紙吸去表面的組織液，使用4℃磷酸緩沖液沖洗后保存備用。

1.6 JAK2與STAT5 mRNA表達的檢測方法 (1)總RNA提取：稱取肝、腎及脂肪組織各50 mg，混合后用于抽提總RNA，液氮預冷后迅速碾壓成粉末，加入Trizol試劑使組織充分裂解，室溫靜置后進行分離(2 500 r/min,-20℃,30 min)；沉淀、漂洗和再溶解，置于-80℃冰箱中保存。(2)RNA濃度及純度測定：用焦碳酸二乙酯水為空白對照，分光光度計測定讀取A260和A280，并計算A260和A280的比值。(3)引物設計：應用Oligo 6.71 Demo軟件輔助設計引物，JAK2 上游引物為(5′-3′)GCT CAG TGG CGG CAT GAT，下游引物為CAC TGC CAT CCC AAG ACA TTC；STAT5上游引物為(5′-3′)CCC TTC CCG TGG TTG T，下游引物為(5′-3′)ATG CCG TTG TAG TCC TC；內參c-Myc上游引物為(5′-3′)ATG CCC CTC AAC GTT AGC，下游引物為(5′-3′)AGC TCG CTC TGC TGC TGC。(4)循環參數：① JAK2：反應體系20 μl；變性溫度95℃，40 s，退火溫度51.3℃，復性時長40 s，循環次數30次。② STAT5：反應體系20 μl；變性溫度95℃，40 s，退火溫度51.0℃，復性時長40 s，循環次數30次。③ c-Myc：反應體系20 μl；變性溫度95℃，40 s，退火溫度55.0℃，復性時長40 s，循環次數30次。應用C1000型PCR儀收集各個基因的Ct值。(5)計算相對表達量：使用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

1.7 統計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析。使用Spearman相關系數進行相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠JAK2 mRNA基因相對表達水平比較 與A組相比，其他3組大鼠的JAK2 mRNA相對表達水平均下降(均P<0.05)；隨著rhGH劑量的上升，B、C、D組的JAK2 mRNA相對表達水平下降(r=-0.941，P<0.001)。各組內處死前注射rhGH及未經處理的大鼠間JAK2 mRNA相對表達水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠JAK2 mRNA基因相對表達水平比較(x±s)

注：組間兩兩比較均P<0.05。

2.2 4組大鼠STAT5 mRNA基因表達水平比較 與A組相比，其他3組大鼠的STAT5 mRNA相對表達水平降低(均P<0.05)；且隨著rhGH劑量的增加，B、C、D組的STAT5 mRNA相對表達水平降低(rs=-0.956，P<0.001)。各組內處死前注射rhGH及未經處理的大鼠間STAT5 mRNA相對表達水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組STAT5 mRNA相對表達水平比較(x±s)

注：組間兩兩比較均P<0.05。

3 討 論

JAK/STAT信號通路轉導始于生長激素受體與生長激素的相結合，生長激素受體通過二聚體的形式與生長激素結構中的單環結構結合，然后可激活自身與JAK2的磷酸化，磷酸化的JAK2又可以激活生長激素受體，形成交叉磷酸化，二者結合生長激素共同形成生長激素-生長激素受體-JAK2多聚體，為下游信號分子提供結合位點[4-5]。國外研究結果顯示JAK/STAT信號通路能夠為多種細胞因子提供傳導途徑，但多種細胞因子也可以抑制JAK/STAT信號通路[6]，其機制已基本清楚，但其如何在傳導過程中進行調控及不同濃度生長激素長期刺激機體是否會對JAK/STAT信號通路產生影響有待于繼續研究。

王娟等[7]發現小鼠處死前注射單劑量生長激素的小鼠肝細胞核磷酸化STAT水平及STAT5 DNA的黏附活性均是長期連續注射生長激素小鼠的2倍，說明rhGH慢性刺激抑制了小鼠JAK/STAT信號轉導通路。本研究結果顯示，經注射rhGH 2周的肥胖小鼠的JAK2及STAT5 mRNA相對表達水平均低于未注射rhGH的A組(均P<0.05)，提示長期給肥胖小鼠注射生長激素可明顯抑制STATS的激活，進而可抑制JAK/STAT信號通路，這可能是由于長期注射生長激素致使機體細胞因子信號抑制物3基因轉錄表達增加，從而調控性抑制JAK-STAT信號通路。此外，本研究結果還顯示，隨著rhGH劑量的增加，肥胖大鼠的JAK及STAT5 mRNA相對表達水平呈下降趨勢(P<0.05)，提示在一定范圍內，rhGH注射劑量越大對JAK/STAT信號通路的抑制越明顯。

本研究采用短時間刺激和長期刺激兩種方式對肥胖大鼠注射rhGH，發現在肥胖小鼠機體正常分泌生長激素情況下，長期注射rhGH可抑制肥胖小鼠JAK/STATS的基因表達水平，但各組內處死前注射rhGH及未經處理的大鼠間JAK2及STAT5 mRNA相對表達水平差異均無統計學意義(均P>0.05)，提示短時注射高劑量rhGH對于肥胖小鼠的JAK及STAT5 mRNA表達無明顯影響，可能是長期注射rhGH降低了機體對處死前注射rhGH刺激的敏感性。如果將處死前注射rhGH視為機體分泌生長激素的峰值，則進行長期注射rhGH刺激或許能夠抑制機體對內源性生長激素的敏感程度，提示長期注射rhGH能夠抑制JAK/STAT信號通路，并使機體對GH敏感性降低，國內相關研究中也得出相似的結論[8-9]。因此，我們認為生長激素不同的刺激方式對JAK/STATS信號通路會造成不同程度的影響，關于其各自的相關機制和作用位點有待于進一步探討。

綜上所述， rhCH慢性刺激可抑制小鼠肝細胞的JAK/STAT5信號轉導通路，且隨著刺激劑量的提高其抑制作用有上升趨勢，但在此基礎上快速rhCH刺激則無顯著作用。