丙酮酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中的菌種篩選與改良

李 瑩，趙 爍，王 震

江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222001

丙酮酸作為一種多功能有機酸，在化學(xué)、醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)據(jù)占有重要地位。傳統(tǒng)的丙酮酸生產(chǎn)方法主要依賴于化學(xué)合成途徑，這些方法雖然可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，但往往伴隨著能耗高和環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。在此背景下，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法得到了廣泛研究。微生物發(fā)酵作為一種可再生的生產(chǎn)手段，不僅有助于減輕對化石燃料的依賴，而且還可以顯著降低環(huán)境污染。廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物發(fā)酵的模型菌種，如釀酒酵母和大腸桿菌，在丙酮酸生產(chǎn)過程中也展現(xiàn)出了顯著的潛力[1]。本研究旨在詳細(xì)探討野生菌種在丙酮酸生產(chǎn)過程中的篩選與改良方法。通過分析釀酒酵母和大腸桿菌在丙酮酸生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力，并結(jié)合遺傳工程和基因編輯技術(shù)對其加以改良，以期提升丙酮酸的發(fā)酵效率和產(chǎn)量，為相關(guān)人員提供參考。

1 丙酮酸概述

1.1 丙酮酸的工業(yè)應(yīng)用和生物合成的重要性

丙酮酸作為一種至關(guān)重要的化學(xué)中間體，在多個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，包括合成藥物、生物塑料和食品添加劑領(lǐng)域。在醫(yī)藥行業(yè)，丙酮酸是許多藥物合成的關(guān)鍵原料，如抗生素和抗癌藥物。同時，丙酮酸也是生物降解塑料聚乳酸（PLA）的前體物質(zhì)，這類塑料非常環(huán)保。在食品工業(yè)中，丙酮酸作為食品添加劑，可用于調(diào)整食品的酸度并維持食品的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成方式相比，生物合成丙酮酸具有低能耗、低污染和可再生等優(yōu)點。微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸不僅符合綠色環(huán)保的原則，還能夠利用可再生資源，如以糖類為原料，減輕對化石燃料的依賴。

1.2 微生物合成丙酮酸的潛力

利用微生物生產(chǎn)丙酮酸不僅符合可持續(xù)發(fā)展的要求，還可以充分利用各種可再生資源，例如農(nóng)業(yè)廢棄物和糖類原料，減輕對傳統(tǒng)化石燃料的依賴。微生物發(fā)酵過程中的丙酮酸生產(chǎn)具有碳效率高、副產(chǎn)品少和過程可控等優(yōu)點，這使其成為了一種高效且經(jīng)濟可行的生產(chǎn)方法。微生物合成丙酮酸的潛力還體現(xiàn)在其可以通過基因工程和代謝工程加以優(yōu)化。

2 野生菌種中丙酮酸的篩選

2.1 野生菌種篩選的標(biāo)準(zhǔn)和方法

在微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的過程中，采用適當(dāng)?shù)囊吧N對于提高效率和產(chǎn)量至關(guān)重要。野生菌種篩選的主要標(biāo)準(zhǔn)包括菌株的丙酮酸產(chǎn)量、生長速度、原料轉(zhuǎn)化效率和耐受性。第一，在篩選過程中重點尋找能夠高效生產(chǎn)丙酮酸的菌種。這涉及對菌株在特定培養(yǎng)條件下產(chǎn)酸能力的評估，包括產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸總量[2]。第二，理想的菌株應(yīng)該生長速度較快，以確保在工業(yè)生產(chǎn)過程中能夠迅速達到所需的細(xì)胞密度。第三，菌株應(yīng)能夠適應(yīng)發(fā)酵過程中的各種應(yīng)激條件，如高濃度的丙酮酸、變化的pH 和潛在的抑制副產(chǎn)品。

2.2 釀酒酵母的丙酮酸篩選實例

發(fā)酵過程是評估不同釀酒酵母菌株生產(chǎn)丙酮酸能力的關(guān)鍵階段。針對釀酒酵母的丙酮酸篩選實施以下實驗。

菌株：從不同來源篩選釀酒酵母菌株，比如釀酒廠、野生果實等。

培養(yǎng)基：含有一定濃度葡萄糖的液體培養(yǎng)基。

發(fā)酵條件：恒溫（30 °C），恒定攪拌速度。

發(fā)酵時間：72 h。

丙酮酸測定：發(fā)酵結(jié)束后，使用高效液相色譜（HPLC）測定發(fā)酵液中的丙酮酸濃度。

實驗數(shù)據(jù)如表1 所示。

表1 釀酒酵母的丙酮酸篩選實驗數(shù)據(jù)

從上述數(shù)據(jù)可以看出，不同來源的釀酒酵母菌株在丙酮酸產(chǎn)量上存在顯著差異。菌株YS04（工業(yè)應(yīng)用菌株）在發(fā)酵過程中的丙酮酸產(chǎn)量最高，特別是在發(fā)酵后期，其產(chǎn)量達到了6.2 g/L，表明其具有較高的丙酮酸生產(chǎn)潛力。菌株YS01（傳統(tǒng)釀酒廠）在發(fā)酵后期丙酮酸產(chǎn)量達到了5.8 g/L，在丙酮酸生產(chǎn)方面也具有較大的潛力。通過對不同菌株的發(fā)酵性能進行評估，可以有效篩選出可以高效產(chǎn)丙酮酸的釀酒酵母菌株。

2.3 大腸桿菌的丙酮酸篩選實例

在用大腸桿菌進行丙酮酸生產(chǎn)的篩選過程中，進行耐酸性測試是非常關(guān)鍵的一步[3]。本次實驗將著重于分析不同大腸桿菌菌株的耐酸性測試，以篩選酸性環(huán)境下能夠穩(wěn)定生產(chǎn)丙酮酸的菌株。實驗設(shè)置如下：

獲取的菌株：Escherichia coli K12 和Escherichia coli B。

培養(yǎng)條件：含有一定濃度葡萄糖的液體培養(yǎng)基。

pH：分別在pH 4.5、5.0 和5.5 的條件下進行耐酸性測試。

測定指標(biāo)：在不同pH 條件下的生長速率和丙酮酸產(chǎn)量。

測定方法：使用吸光度測量生長速率，使用HPLC 測定丙酮酸產(chǎn)量。

實驗結(jié)果如表2 所示。

表2 大腸桿菌的丙酮酸篩選實驗數(shù)據(jù)

從上述數(shù)據(jù)可以看出，Escherichia coli K12 在所有測試的pH 環(huán)境下都表現(xiàn)出了較快的生長速率和較高的丙酮酸產(chǎn)量，尤其在pH 為5.5 時，其生產(chǎn)丙酮酸的能力最強，為3.7 g/L。相比之下，Escherichia coli B 在pH 較低，生長較慢且丙酮酸產(chǎn)量較低的條件下，耐酸性相對較差。結(jié)果表明，Escherichia coli K12 菌株在生產(chǎn)丙酮酸時具有較好的耐酸性，適合在酸性環(huán)境下進行丙酮酸生產(chǎn)。因此，選擇Escherichia coli K12 作為發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的菌株會更加有效。

2.4 高通量篩選技術(shù)在丙酮酸生產(chǎn)中的應(yīng)用

高通量篩選實驗旨在評估多種菌株的丙酮酸生產(chǎn)能力。實驗設(shè)置如下：

實驗?zāi)康模簭亩喾N菌株中快速篩選可以高效生產(chǎn)丙酮酸的微生物。

實驗樣本：包括多個不同來源的大腸桿菌和釀酒酵母菌株。

實驗方法：利用自動化微孔板技術(shù)進行微生物培養(yǎng)，并通過高效液相色譜（HPLC）分析丙酮酸產(chǎn)量。

參數(shù)：監(jiān)測每個菌株的生長速度和丙酮酸產(chǎn)量。

實驗結(jié)果如表3 所示。

表3 高通量篩選實驗數(shù)據(jù)

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，可以觀察到大腸桿菌菌株EC-02 和釀酒酵母菌株SC-03 都表現(xiàn)出了較高的丙酮酸產(chǎn)量和較快的生長速度，這表明它們是生產(chǎn)丙酮酸的理想候選菌株。EC-02 作為工業(yè)株，在丙酮酸生產(chǎn)方面優(yōu)勢明顯，而SC-03 作為工業(yè)釀酒酵母株，其高產(chǎn)量也彰顯了其良好的發(fā)酵潛力。通過這種高通量篩選實驗，研究人員能夠快速評估大量菌株的丙酮酸生產(chǎn)能力，并有效篩選出最佳生產(chǎn)菌株。

3 菌種的遺傳工程改良

3.1 遺傳工程在菌種改良中的作用

遺傳工程在微生物菌種改良中可以提高丙酮酸的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。遺傳工程技術(shù)使研究人員可以精確修改微生物的基因組，從而優(yōu)化其代謝路徑，增強特定代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，提高其對某些環(huán)境壓力的耐受性。一方面，遺傳工程可以用于提高微生物對原料的轉(zhuǎn)化效率。通過修改特定代謝途徑，例如增強與丙酮酸生產(chǎn)相關(guān)的酶的活性或表達水平，可以提高丙酮酸的合成效率。這種改造不僅提高了丙酮酸的產(chǎn)量，還可以減少原料損耗和生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。另一方面，遺傳工程能夠增強菌株的耐受性，使其在丙酮酸積累或環(huán)境壓力（如低pH、高鹽度或氧氣限制條件）下依然可以保持穩(wěn)定生長和高效生產(chǎn)。

3.2 釀酒酵母和大腸桿菌的遺傳改造策略

在微生物發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸的過程中，釀酒酵母和大腸桿菌是兩種常用的生產(chǎn)菌株。這兩種微生物因遺傳背景清晰和易于遺傳操縱的特性，成為了遺傳改造的理想對象，有利于提高丙酮酸的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量。對于釀酒酵母的遺傳改造策略，主要集中于優(yōu)化其丙酮酸的生物合成途徑。包括增強與丙酮酸代謝直接相關(guān)的酶的活性，還可以通過消除代謝途徑中與丙酮酸生產(chǎn)競爭的關(guān)鍵酶基因，如敲除產(chǎn)生乙醇或二氧化碳的途徑，將更多碳流向丙酮酸的生產(chǎn)。

4 結(jié)論

文章深入探討了丙酮酸的微生物發(fā)酵生產(chǎn)原理，重點研究了野生菌種的篩選和菌種的遺傳改良工程。通過對釀酒酵母和大腸桿菌等微生物菌株進行篩選和基因編輯，能夠顯著提高丙酮酸的產(chǎn)量和發(fā)酵效率。希望本文的研究可以為未來的工業(yè)生產(chǎn)提供可行的改良策略。