H2O2對(duì)白木香細(xì)胞生長(zhǎng)和揮發(fā)性次生產(chǎn)物的影響

蔡 淼，李 明，董 閃，李敬輝

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006)

【研究意義】白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Gilg]為國(guó)產(chǎn)沉香的唯一正品來源[1]，由于其自然繁殖率低， 森林資源、生態(tài)環(huán)境遭受自然災(zāi)害和人為破壞， 加上掠奪式的砍伐，其野生資源幾乎已經(jīng)枯竭[2]。白木香含樹脂的心材部分稱為沉香，具行氣止痛、納氣平喘、溫中止嘔的功效，主要治療胸腹脹痛、畏寒呃逆、腎虛氣喘癥[3]。白木香的重要價(jià)值體現(xiàn)在結(jié)香產(chǎn)物上，白木香結(jié)香過程是復(fù)雜的防御脅迫反應(yīng)，誘導(dǎo)子誘導(dǎo)白木香結(jié)香是方法之一，本實(shí)驗(yàn)研究H2O2對(duì)白木香細(xì)胞生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物的影響，為揭示白木香結(jié)香機(jī)制提供依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利等化學(xué)誘導(dǎo)子能誘導(dǎo)白木香細(xì)胞沉香類成分的產(chǎn)生[4]。H2O2是一種活性氧，也是植物響應(yīng)逆境脅迫的重要信號(hào)分子，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、植保素的合成中發(fā)揮重要作用[5]，其在大豆、白苜蓿、番茄等其他植物上的研究中有證實(shí)[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究開展對(duì)白木香懸浮細(xì)胞施用不同濃度的H2O2的實(shí)驗(yàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在本實(shí)驗(yàn)室之前關(guān)于白木香細(xì)胞愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上對(duì)白木香細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)后[7]，在培養(yǎng)基中添加H2O2溶液，通過檢測(cè)生長(zhǎng)指標(biāo)和化學(xué)成分，探究不同濃度的H2O2白木香細(xì)胞生長(zhǎng)及揮發(fā)性成分的影響，為白木香結(jié)香機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)采用的白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Gilg]懸浮細(xì)胞來源于實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng)獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)子的制備 配置不同濃度的H2O2溶液，過0.45 μm過濾膜過濾后取適量的H2O2溶液加入第1天的白木香懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入H2O2溶液的濃度分別為1、5、10、30、50 mmol/L，以無菌水作為空白對(duì)照。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 參照董閃等[7]的方法，選取白木香無菌苗的莖段為外植體在培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+3.0 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH=5.8)中誘導(dǎo)出的愈傷組織作為繼代材料，先接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基(3.0 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH=5.8)中生長(zhǎng)7 d，再取長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定、顏色正常的愈傷組織接種于培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+3.0 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH=5.8)中繼代45 d得淡黃色疏松型愈傷組織。將該愈傷組織懸浮培養(yǎng)于培養(yǎng)液(1/2MS+1.0 mg/L 6-BA)中,再置于恒溫?fù)u床上25℃暗培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速110 r/min條件下培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞鮮重的檢測(cè) 在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的H2O2，培養(yǎng)3 d后取出愈傷組織，用濾紙吸干表面水分，用萬分之一天平稱量其質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 細(xì)胞活力的檢測(cè) 參照Miku和王躍華等[8-9]的方法，采用TTC法，取0.25 g愈傷組織，加0.4 %TTC溶液2.5 mL和pH為7的磷酸緩沖溶液2.5 mL染色4 h,取出染色液，蒸餾水洗3次，加5 mL甲醇溶解，60 ℃水浴30 min后取溶液檢測(cè)其吸光度。

1.2.5 細(xì)胞沉降體積的測(cè)定 參照史昆[10]等的方法并加以修改，用移液器吸取10 mL懸浮液于精密刻度試管中，靜置30 min后讀取沉降細(xì)胞的體積即為SCV值。

1.2.6 白木香細(xì)胞POD活性的測(cè)定 參照李玲[11]的方法，取樣品0.2 g，加入預(yù)冷的磷酸緩沖液5 mL，于10 mL EP管中搗碎，靜置20 min，4000 r/min離心10 min，收集上清液即為酶液，測(cè)定470 nm處的OD值的變化，酶活性的大小以每克樣品每分鐘OD值的變化值表示。

1.2.7 白木香細(xì)胞MDA含量的測(cè)定 參照李玲等[11]的方法，取樣品0.2 g，加入TCA溶液5 mL，于10 mLEP管中搗碎，靜置20 min，4000 r/min離心10 min，收集上清液即為MDA提取液。測(cè)定532 和450 nm處的OD值，計(jì)算MDA的含量。

1.2.8 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 在添加不同濃度H2O2后的第3天取樣檢測(cè)，按照植物組織DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，將提取后的DNA樣品于1.0 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓110 V，時(shí)間30 min，電泳完畢后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.2.9 白木香細(xì)胞揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的提取及檢測(cè) 參照張娟芳等[12]的方法制備白木香懸浮培養(yǎng)物供試品溶液，取10 g懸浮培養(yǎng)物，濾紙吸干表面水份倒入研缽中簡(jiǎn)單研磨，轉(zhuǎn)移至100 mL具塞錐形瓶中，加30 mL三氯甲烷溶液，密封，冰浴超聲30 min，冷浸過夜；搖勻過濾，濾渣反復(fù)過濾3次，收集濾液，65 ℃水浴蒸干，殘?jiān)? mL三氯甲烷溶液溶解，微孔濾膜過濾，濾液轉(zhuǎn)移值1 mL容量瓶中定溶，密封冷藏，再采用GC-MS方法檢測(cè)所配置溶液中的成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2對(duì)白木香懸浮細(xì)胞鮮重和活力的影響

如表1所示，白木香懸浮體系的鮮重隨H2O2處理濃度的增加呈降低的變化，當(dāng)H2O2濃度高于1 mmol/L時(shí)，其鮮重與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯降低的變化(P<0.05)，在高濃度(30 和50 mmol/L)H2O2處理下，生長(zhǎng)后的鮮重低于初始接種量。采用TTC法測(cè)定樣品活力后發(fā)現(xiàn)，白木香細(xì)胞活力隨著H2O2處理濃度的升高呈顯著下降的變化趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí)其細(xì)胞活力與對(duì)照組相比降低了約93.3 %。

表1 不同濃度H2O2對(duì)白木香懸浮細(xì)胞鮮重和活力的影響

注：增殖倍數(shù)=培養(yǎng)后的鮮重/培養(yǎng)前的鮮重，表中標(biāo)有相同字母的數(shù)據(jù)表示同列之間比較沒有顯著性差異(P>0.05)，標(biāo)有不同字母的數(shù)據(jù)表示表示同列之間比較有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Proliferation rate = fresh weight after culture / fresh weight before culture. The data with the same letters in the table indicated that there was no significant difference between the same columns (P>0.05),data marked with different letters showed significant difference between the same columns (P<0.05).

2.2 不同濃度對(duì)白木香懸浮細(xì)胞沉淀體積(SCV)的影響

SCV能夠反應(yīng)懸浮細(xì)胞液實(shí)際存在的細(xì)胞數(shù)量，其數(shù)值越大說明培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)量越多[13]；如圖1所示，各培養(yǎng)的時(shí)間內(nèi)，SCV均隨H2O2濃度的升高而下降(P<0.05)，其中與對(duì)照組比較，10、30和50 mmol/L 3個(gè)組的SCV值在第1天就出現(xiàn)明顯下降的變化，培養(yǎng)第3天時(shí)，10、30和50 mmol/L H2O2處理的細(xì)胞的SCV分別較對(duì)照降幅值相近。

2.3 不同濃度H2O2對(duì)白木香細(xì)胞POD活性的影響

過氧化物酶(POD)是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的氧化還原類酶，其主要作用是催化H2O2氧化分解，清除H2O2對(duì)細(xì)胞的破壞作用[14]。如圖2所示，在培養(yǎng)12 h前，0～5 mmol/LH2O2處理下，POD活性均較對(duì)照均顯著升高，各處理均在培養(yǎng)6 h時(shí)POD活性最高，隨后POD活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低的變化，低濃度組(1 mmol/L)和中濃度組(5 和10mmol/L)POD活性在6 h達(dá)到最大值，高濃度組(30 和50 mmol/L)POD活性在4 h達(dá)到最大值，其中5 mmol/L處理組的POD最大活性明顯高于其它組；當(dāng)處理時(shí)間超過2 d時(shí)，低中濃度組(1、5和10 mmol/L)的POD活性恢復(fù)到了初始狀態(tài)，而高濃度組(30 和50 mmol/L)的POD活性已基本喪失。

圖1 不同濃度H2O2對(duì)白木香懸浮細(xì)胞SCV的影響Fig.1 Effects of different concentration of H2O2 on cell SCV of Aquilaria sinensis

2.4 不同濃度H2O2對(duì)白木香細(xì)胞MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量大小可間接反應(yīng)植物細(xì)胞組織受損傷的大小[15]。不同濃度H2O2對(duì)白木細(xì)胞MDA含量的影響結(jié)果如圖3，不同濃度處理組的MDA含量在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，均隨濃度的升高呈升高的變化，在4 h達(dá)到第1次高峰，而后降低，在8 h達(dá)到最低值，隨后各濃度培養(yǎng)均隨時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量升高。在培養(yǎng)第3天時(shí)，高濃度處理組(30 和50 mmol/L)的MDA含量顯著高于對(duì)照組。

圖2 不同濃度H2O2對(duì)白木香細(xì)胞POD活性的影響Fig.2 Effects of different concentration of H2O2 on cell POD activities of Aquilaria sinensis

圖3 不同濃度H2O2對(duì)白木細(xì)胞MDA含量的影響Fig.3 Effects of different concentration of H2O2 on MDA of Aquilaria sinensis

M：DNA marker；A：對(duì)照；B：1 mmol/L；C：5 mmol/L；D：10 mmol/L；E：30 mmol/L；F：50 mmol/L圖4 不同濃度H2O2處理后的白木香細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Cellular DNA agarose gel electrophoresis of Aquilaria sinensis under different concentrations of H2O2

2.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳

DNA瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用在動(dòng)植物細(xì)胞的PCD檢測(cè)當(dāng)中，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生PCD時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)DNA會(huì)降解成100～200 bp及其整數(shù)倍的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可觀察到“DNA Ladder”圖譜[15]。經(jīng)過不同濃度H2O2處理后，白木香細(xì)胞中的DNA均發(fā)生了不同程度的降解，其中，低濃度(1 和5 mmol/L)組降解條帶明顯，中濃度組(10 mmol/L)出現(xiàn)梯形條帶的出現(xiàn)，說明添加不同濃度H2O2后，白木香細(xì)胞中的DNA均出現(xiàn)降解。圖4為經(jīng)過不同濃度H2O2處理后的白木香細(xì)胞DNA電泳圖，從圖中可看出，5個(gè)處理組均出現(xiàn)不同程度降解帶，其中，1 和5 mmol/L H2O2組(圖4，B和圖4，C)，在100～500 bp之間出現(xiàn)DNA降解帶較明顯；10 mmol/L H2O2組(圖4，D)，在100～1200之間出現(xiàn)梯狀DNA降解帶；30 和50 mmol/L H2O2組(圖4，E和圖4，F(xiàn))，在100～500 bp之間出現(xiàn)較淡降解帶；而對(duì)照組(圖4，A)無降解條帶。

2.6 不同濃度H2O2對(duì)白木香細(xì)胞次生產(chǎn)物的影響

表2 不同濃度H2O2對(duì)白木香細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的影響

續(xù)表2 Continued table 2

序號(hào)化合物含量( %)ABCDEF24高瓜氨酸-1.943.702.461.46-25癸醛---2.50--261,4-雙(1-甲基乙基)苯--1.342.52--272,4,6-三甲基辛烷1.761.68----282-脫氧-D-半乳糖----2.14-294-甲基庚烷1.380.72----302-甲基十五烷2.62-----311-(4-叔丁基甲基)丙-2-酮----1.37-32硫酸--2.340.74-1.12332,4,6-三甲基辛烷1.761.683.64---344-乙酰氨基丁酸-0.722.13---355-茚醇-13.88---0.51361-(芐氧基)8-萘酚14.12-----37氨基甲酸-1.48----38十六烷基磺酰氯---1.79--39肉桂酸---5.04--40十二烷基乙二醇-1.49-3.09-1.14413,5-二甲基苯丙胺-1.551.104.971.882.33萜類化合物( %)0006.3200芳香族化合物( %)16.0621.078.9013.0210.219.53有機(jī)酸類化合物( %)20.1618.5713.3912.319.754.88烷烴類化合物( %)26.5928.2915.2013.927.8010.17其它化合物( %)10.246.865.4810.986.656.11

注：表中A、B、C、D、E、F分別代表對(duì)照組、1 mmol/L H2O2處理組、5 mmol/L H2O2處理組、10 mmol/L H2O2處理組、30 mmol/L H2O2處理組和50 mmol/L H2O2處理組。

Note: A, B, C, D, E and F in the table represent control group, 1 mmol/L H2O2treatment group, 5 mmol/L H2O2treatment group, 10 mmol/L H2O2treatment group, 30 mmol/L H2O2treatment group and 50 mmol/L H2O2treatment group respectively.

如表2所示，在對(duì)照組和5個(gè)不同濃度H2O2處理組中，檢出成分主要有烷烴類化合物、有機(jī)酸類化合物和芳香族類化合物。低濃度處理組(1 mmol/L)的芳香族化合物含量和烷烴類化合物含量最高，分別達(dá)到了21.07 %和28.29 %，對(duì)照組的有機(jī)酸類化合物含量最高，達(dá)到了20.16 %。所有實(shí)驗(yàn)組均檢測(cè)出芳香族類化合物2,5-二叔丁基酚，脂肪酸類化合物棕櫚酸和硬脂酸，而萜類化合物僅在10 mmol/L處理組中被檢測(cè)出。

對(duì)照組與處理組比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組檢測(cè)出1-(芐氧基)8-萘酚、油酸、三十二烷、2-甲基十五烷等特殊成份，處理組則檢測(cè)出2-十二烷基苯、3,5-二甲基苯丙胺、高瓜氨酸、4-乙酰氨基丁酸、氨基甲酸等特殊成分；5個(gè)處理組之間比較發(fā)現(xiàn)，低濃度處理組(1 mmol/L)芳香族類化合物和烷烴類化合物含量要明顯高于其它組，10 mmol/L處理組檢測(cè)出長(zhǎng)葉烯(3.27 %)、角鯊烯(3.05 %)、十六烷基磺酰氯(1.79 %)、肉桂酸(5.04 %)等多種沉香類成分[16]，而高濃度處理組(30 和50 mmol/L)有機(jī)酸和芳香族類化合物的種類和含量均顯著下降。

3 討 論

研究表明，H2O2作為一種活性氧(ROS)，也是一種重要的信號(hào)分子，在調(diào)控植物抵御逆境中發(fā)揮重要的作用，并參與調(diào)節(jié)植物生理生化代謝、相關(guān)酶與基因激活、細(xì)胞死亡及植保素類的形成和積累方面都發(fā)揮重要的作用[17-18]。H2O2是植物中最穩(wěn)定的活性氧分子之一，ROS機(jī)制在植物的防御反應(yīng)中起重要的作用，在許多研究中被證實(shí)。用H2O2處理培養(yǎng)的細(xì)胞可以誘導(dǎo)保護(hù)反應(yīng)和細(xì)胞死亡[19]，ROS 的產(chǎn)生與植保素的合成也有密切的關(guān)系，在菜豆、大豆、白苜蓿、番茄和其他植物上的研究中均有證實(shí), ROS 和植保素之間確實(shí)存在高度的相關(guān)性[20]。研究發(fā)現(xiàn)，外源 H2O2對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡和生長(zhǎng)素分布有影響[21]， 一定濃度的H2O2能增加燕麥苗中可溶性糖、蛋白質(zhì)、脯氨酸等滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性，減輕膜脂氧化傷害與燕麥苗生長(zhǎng)受抑制程度，增強(qiáng)燕麥的耐鹽性[22]。外源噴施H2O2能夠增加苦菜幼苗可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高抗氧化酶SOD、POD、CAT 和 APS 酶的活性[23]。本實(shí)驗(yàn)表明，白木香細(xì)胞的生長(zhǎng)、活力、SCV均隨H2O2濃度的升高而顯著降低，高濃度H2O2處理可以導(dǎo)致白木香細(xì)胞死亡。

MDA是表示膜質(zhì)過氧化的指標(biāo)，其值越高，表示膜質(zhì)過氧化程度越高，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重[14]。本研究表明，白木香細(xì)胞的MDA含量隨H2O2濃度的升高而升高，表明高濃度的H2O2能夠?qū)е掳啄鞠慵?xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫。POD是植物體內(nèi)的重要的抗氧化酶之一，低濃度處理的白木香細(xì)胞POD活性在生長(zhǎng)前期呈顯著升高的變化，在生長(zhǎng)后期呈急劇降低的變化；高濃度處理的細(xì)胞POD活性在培養(yǎng)期內(nèi)均顯著低于低、中濃度處理的，在生長(zhǎng)后期，高濃度處理的細(xì)胞POD活性已基本喪失，可能與高濃度H2O2處理下的白木香細(xì)胞發(fā)生了大量死亡有關(guān)。通過GC-MS技術(shù)檢測(cè)H2O2對(duì)白木香細(xì)胞的揮發(fā)油成分的影響，結(jié)果表明，經(jīng)過H2O2處理，白木香細(xì)胞次生產(chǎn)物的種類和含量都發(fā)生了一定的變化。低濃度處理組(1 mmol/L)的芳香族化合物含量和烷烴類化合物含量最高，而僅在10 mmol/L處理組檢測(cè)出長(zhǎng)葉烯(3.27 %)和角鯊烯(3.05 %)2種萜類化合物，高濃度處理組中有機(jī)酸和芳香族類化合物的種類和含量均呈降低的變化，有關(guān)H2O2對(duì)白木香細(xì)胞次生產(chǎn)物的組分及含量影響的相關(guān)機(jī)制仍需深入開展。

4 結(jié) 論

外源H2O2對(duì)白木香細(xì)胞的生長(zhǎng)、活力產(chǎn)生影響，隨濃度的升高而降低，至一定濃度時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，一定濃度的H2O2能夠誘導(dǎo)白木香細(xì)胞的長(zhǎng)葉烯(3.27 %)和角鯊烯(3.05 %)、十六烷基磺酰氯(1.79 %)、肉桂酸(5.04 %)等多種沉香類成分的形成。