昆明小鼠放射性肺炎病理觀察

楊 鈐 馮瑪莉 朱麗娜 仝立國

(山西省中醫(yī)藥研究院臨床藥理研究室，太原 030002)

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療、骨髓移植等預(yù)處理后常見的并發(fā)癥，嚴重時加速患者死亡[1]。病程可分為早期急性肺炎和晚期放射性肺纖維化2期[2]。本研究模擬臨床放療條件，制備昆明小鼠放射性肺炎模型，闡明疾病發(fā)生發(fā)展過程肺部病理變化，為中藥治療奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本(對象)選擇及分組

昆明小鼠，雌雄各半，5周齡，體質(zhì)量為(20±2)g，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：[SCXK(京)2014-0004]。動物飼養(yǎng)條件：同時分籠飼養(yǎng)于山西省中醫(yī)藥研究院中心實驗室，自然光照，自由進水，室內(nèi)溫度18～29 ℃，濕度36%～60%。

將實驗小鼠隨機分為4組：空白對照組以及模型組照射后7th、14th、28th 3組。每組10只，雌雄各半。

1.2 模型制備

動物經(jīng)3%戊巴比妥麻醉后，采用6MV的X射線20Gy單次全胸照射(圖1)造模，照射位置為頭部下方、劍突以上，照射野面積2 cm×3 cm，劑量率：2 Gy/min，放射源距皮100 cm。空白組不做任何處理。

圖1 6MV的X射線20Gy單次全胸照射， 放射源距皮100 cmFig.1 20 Gy cumulative dose of 6MV X-ray irradiation of full chest once, and source-skin distance=100 cm

1.3 取材及常規(guī)病理觀察

分別于照射后第7、14、28天后殺檢取材，肺臟經(jīng)宏觀觀察后，與心臟一起包入紗布中置于10%中性甲醛溶液進行固定。取左肺葉和右肺中葉，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后，經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察肺臟組織病理學(xué)形態(tài)改變。

1.4 HE染色步驟

二甲苯I-1 10 min→二甲苯I-2 10 min→二甲苯I-3 10 min→無水乙醇I 5 min→95%乙醇 I 5 min→75%乙醇I 5 min→蘇木素 4 min→自來水清洗→0.5%鹽酸 5 s→自來水清洗→1%氨水 5 s→自來水清洗→伊紅 2 min→75%乙醇II 5 s→85%乙醇 5 s→95%乙醇II 5 s→無水乙醇II 10 min→二甲苯II-1 10 min→二甲苯II-2 10 min→二甲苯II-3 10 min[3]。

1.5 圖像分析

采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)檢測組織切片中肺泡壁厚度、肺泡腔面密度(肺泡腔面積/視野單位面積)、肺間質(zhì)面密度(肺間質(zhì)面積/視野單位面積)[4]。每張切片隨機選取5個視野測量。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 照射后KM小鼠臨床表現(xiàn)

照射3 d后，KM小鼠背部胸段照射野被毛脫落，狀態(tài)萎靡。

2.2 組織病理學(xué)形態(tài)變化

空白對照組肺實質(zhì)與間質(zhì)部分病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)均正常(圖2-A)。模型組照射7 d后可見輕度肺炎，肺泡間隔增寬、少量炎細胞浸潤(圖2-B)。照射14 d后表現(xiàn)為輕-中度肺炎，肺泡塌陷，炎細胞浸潤肺泡間隔，破壞肺泡結(jié)構(gòu)，輕度滲出(圖2-C)。照射4周后可見重度肺炎，肺泡塌陷實變，炎細胞大量浸潤，輕度纖維化改變，毛細血管充血，氣管支氣管上皮雜亂、脫落(圖2-D)。

圖2 組織病理學(xué)形態(tài)變化 HE ×100注：A： 空白對照組；B： 20Gy照射后7 d；C： 20Gy照射后14 d；D： 20Gy照射后4周Fig.2 Lung histopathological changes HE×100Note:A: Blank control group; B: 7 d after 20Gy irradiation; C: 14 d after 20Gy irradiation; D: 4 weeks after 20Gy irradiation

2.3 定量測定

正常對照組與模型組肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺間質(zhì)面密度變化見表1。照射20Gy后，隨時間延長，肺泡壁增厚，第7、14、28天測量結(jié)果差異顯著(P<0.01)；肺泡腔萎縮，面積減小，第7天后差異顯著(P<0.05)，第14、28天后差異極顯著(P<0.01)；肺間質(zhì)增寬，面積增大，第14、28天后測量差異極顯著(P<0.01)。

表1 肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺間質(zhì)面密度測量結(jié)果Table 1 The determination of thickness of alveolar walls and surface mass density of alveolar spaces and interstitial tissue

注：*P<0.05；**P<0.01

Note：*P<0.05 vs control,**P<0.01 vs control

3 討論

放射性肺炎系由肺癌、食管癌、乳腺癌或胸部其他惡性腫瘤經(jīng)放射治療后,在放射野內(nèi)的正常肺組織受到損傷而引起的炎癥反應(yīng)，該病的發(fā)生率為5%～50%，嚴重肺炎發(fā)生率為10%～20%，病死率高達50%[5]。盡管近年來治療手段不斷進步,尤其是中醫(yī)辨證治療放射性肺炎具有較好的療效[6]，但是該病的發(fā)生率仍高達30%。放射性肺炎的發(fā)生發(fā)展對機制研究及防治措施的優(yōu)化至關(guān)重要，綜合遺傳背景、研究費用及操作難易程度等因素，選擇昆明種小鼠作為實驗動物[7-8]。模擬臨床放療條件建立放射性肺炎模型，闡明放射性肺炎發(fā)生發(fā)展過程的病理變化。

參照周仟等、白蘊紅等[9-10]方法，采用6MV的X線單次大劑量20Gy照射復(fù)制小鼠放射性肺損傷模型，分別于照射后第7、14、28天，觀察小鼠一般體征，并進行病理HE染色觀察。射線照射3 d后出現(xiàn)活動減少、精神萎靡、體質(zhì)量減輕、胸背部脫毛等狀況。此外，隨著觀察時間的延長，肺泡，肺間質(zhì)均出現(xiàn)進行性病變，通過實驗發(fā)現(xiàn)，6MV的X線20Gy輻照對肺部病變有明顯影響。昆明小鼠輻照第7天后，肺間質(zhì)增寬，炎細胞輕度浸潤；輻照第14天后，肺泡塌陷，肺間質(zhì)進一步增厚，炎細胞浸潤明顯，紅細胞輕度滲出，表明肺部病變已初步出現(xiàn)；而輻照第28天后，肺泡萎縮實變，炎細胞大量浸潤，毛細血管充血，氣管支氣管上皮雜亂、脫落，出現(xiàn)輕度纖維化改變，表明肺部病變已經(jīng)非常明顯。此外，通過統(tǒng)計學(xué)定量分析結(jié)果，顯示輻照第14、28天后肺泡壁厚度、肺泡腔面積、肺間質(zhì)面積變化極顯著(P<0.01)。本次實驗主要偏向于從宏觀、表觀方向選擇表征放射性肺炎病變的關(guān)鍵指標，如肺泡壁厚度、肺泡腔面積、肺間質(zhì)面積等進行觀察描述，下一步應(yīng)從分子生物學(xué)角度對放射性肺炎的病理機理予以進一步觀察和驗證。綜上所述，病理學(xué)研究結(jié)果符合放射性肺炎的病變規(guī)律[8]，可用于進一步藥理研究。