重組人干擾素內皮抑制肽融合蛋白抗腫瘤藥效的研究

劉賀煜 王 瑩 劉錦輝 姜媛媛 黃 炎 李會成

(1. 哈藥集團生物工程有限公司,哈爾濱 150020)(2. 哈藥集團技術中心，哈爾濱 150020)

腫瘤新生血管可為不斷浸潤生長的原發腫瘤提供營養，它們在腫瘤的發展轉移過程中起到重要的促進作用。IFN具有抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤轉移的作用[1]。

內皮抑素是由膠原蛋白XIII羧基末端的184個氨基酸組成的一種內源性血管生成抑素，于1997年由O’Reilly等發現。它能特異性地抑制內皮細胞的增殖和血管的生成，從而達到抑制腫瘤生長和轉移的作用[2]。本實驗所使用的30肽，是一種具有30個氨基酸的內皮抑素。已有研究證實，內皮抑素活性區主要在N端的1～27個氨基酸上[3]。而30肽是一種人工合成的人內皮抑素,它保留內皮抑素的活性，而分子量大大減少。

重組人干擾素內皮抑制肽融合蛋白(以下簡稱I30)，是由干擾素(Interferon，IFN)和重組人內皮抑素(以下簡稱30肽)組成的一種融合蛋白。干擾素和30肽在抗腫瘤方面有著相近似的作用機理，將它們制成融合蛋白，有著協調作用，增強抗腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼育環境

實驗動物：NIH小鼠體質量18～22 g，雌性，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2015-0001]。實驗場所為本公司(哈藥集團生物工程有限公司)實驗室[SYXK(黑)2015-008]。60Co滅菌全價顆粒飼料，購于北京科澳協力飼料有限公司[SCXK(京)2014-0010]，飲用水為滅菌水，自由采食和飲水。

1.2 試劑與材料

腫瘤瘤株：H22瘤株由本公司(哈藥集團生物工程有限公司)實驗室提供。

1.3 實驗藥品

干擾素IFN(哈藥集團生物工程有限公司生產)，干擾素30肽融合蛋白(I30)(哈藥集團技術中心基因工程實驗室制備)，30肽(哈藥集團技術中心基因工程實驗室制備)。

1.3 實驗方法

1.3.1荷瘤小鼠模型制作：取4只小鼠腹腔注射H22瘤株，1周后處死所有小鼠，取腹水。

另取40只小鼠，腋下注射腹水0.2 mL/只，細胞濃度為1×106個/mL。

1.3.2實驗動物分組與給藥：參考《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床評價的技術指導原則》等[4-10]的實驗方法設計實驗方案，接種后4 h開始給藥。將腋下注射小鼠隨機分為4組，每組10只：IFN組，皮下注射干擾素9×105IU/只；I30高劑量組，皮下注射I30 80 μg/只；I30低劑量組，皮下注射I30 30 μg/只；陰性對照組，皮下注射等體積生理鹽水。連續給藥16 d。

1.3.3小鼠腫瘤質量測定：停藥后2 h，處死所有動物，取下瘤塊稱重。

1.4 抑瘤率(%)計算

參考《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床評價的技術指導原則》[4]設計計算公式。抑瘤率公式：抑瘤率=(1-T/C)×100%。(T：治療組；C：陰性對照組)。

1.5 統計方法

2 結果

對照組小鼠平均瘤重為1.605 g，大于1 g，表明本次實驗腫瘤生長良好[11]。試驗結果表明I30高劑量組和低劑量組抑瘤率均高于40%[4]，且其效果優于干擾素。在試驗結束時，所有小鼠雖體型消瘦，但精神狀態良好，飲食飲水正常。提示該融合蛋白具有抗腫瘤作用,見表1。

表1 各組小鼠腫瘤質量Table 1 Tumor weight of mice in each group

注：*表示與對照組比較，*P<0.05

Note:*indicate compared with the control group,*P<0.05

3 討論

腫瘤一直是醫學治療的難題。目前已有多個通過抑制血管生成的抗腫瘤藥物上市，如世界上首個上市的恩度，在臨床上獲得了不錯的療效。腫瘤的產生同時伴著新生血管的生成，腫瘤需要腫瘤血管為其提供營養成分和運輸代謝物。腫瘤的擴散轉移同樣需要腫瘤血管。抑制了腫瘤血管的生成，將會抑制腫瘤的生長與擴散。目前關于內皮抑素的作用機制尚未完全定論。根據已有的研究結果表明，內皮抑素與整合素α5β1的結合在其活性機制中有著重要作用。內皮抑素通過其N末端與整合素α5β1結合，抑制bFGF誘導的FAK/c-Raf/NAKl/2/p38/ERKl絲裂活化蛋白激酶途徑，從而發揮其活性作用[2]。將內皮抑素N-端的27 個氨基酸核心序列，引入串聯的RGD 短肽，構成的新的肽鏈，命名為人血管內皮抑制肽。該肽在保持內皮抑素原有的抑制血管生成活性同時，由RGD 序列賦予其抑制腫瘤細胞生長與轉移的活性，可增強其抗腫瘤效果，而且氨基酸序列較內皮抑素更為簡單[13]。而在成年人的身體中，幾乎不會有新生血管生成，抑制血管生成的藥物因此不會對人體產生副作用，其安全性遠遠高于細胞毒類抗腫瘤藥物。抑制血管生成的藥物藥效好，副作用小，是未來抗腫瘤藥物研發的一個重要的課題。

干擾素α雖然被廣泛用于抗病毒，但美國FDA最早批準干擾素α的適應癥卻是毛細胞白血病(毛細胞白血病是一種淋巴系統的惡性腫瘤，由于此種白血病細胞在顯微鏡下，尤其在電子顯微鏡下其胞漿有明顯的毛狀突起，故稱為毛細胞，因而命名為毛細胞白血病。廣義上仍為一種特殊類型的慢性淋巴細胞白血病。毛細胞白血病主要見于老年男性，男女比例為4∶1)。研究表明，干擾素抗腫瘤作用機理中抑制腫瘤血管生成和30肽抗腫瘤的作用機理接近。IFN可抑制VEGF、b-FGF、MMP(基質金屬蛋白酶)的表達，是其抗血管生成的重要機制之一。IFN能夠降低VEGF、b-FGF等血管形成因子的產生，減少腫瘤新生血管形成[14]。

細胞因子可以介導機體多種免疫反應，如腫瘤免疫、感染免疫、移植免疫、自身免疫及造血系統等過程中發揮著重要的作用。細胞因子的作用具有多相性、網絡性的特點，它們不僅可以單獨地發揮生物學活性，而且不同的細胞因子之間還有相互協調和相互制約的作用，利用細胞因子的這一特點，人們可以根據自己的設想，通過基因融合等技術創造出自然界原本不存在的活性更佳的細胞因子融合蛋白[16]。目前FDA已經批準了不少融合蛋白類藥物上市。如Enbrel(依那西普/etanercept)，在治療類風濕性關節炎已取得了很不錯的臨床效果。隨著基因工程技術的成熟與應用，兩個甚至多個不同基因之間很容易做到相互串聯或彼此鑲嵌，形成嵌合基因，一旦表達成產物則獲得融合蛋白[15]。

本次試驗結束時，給藥組和陰性對照組小鼠，均是體型消瘦，但狀態良好，提示了I30的毒性較小。I30的作用為抑制血管生成。在成年人的身體中，幾乎不會有新生血管生成，抑制血管生成的藥物因此不會對人體產生副作用。

本次實驗沒有采用裸鼠接種人源瘤株的方法。是因為本課題還處于前期研究的階段，并沒有進入到通過動物實驗來篩選抗腫瘤譜的階段。在后續研究中，采用通過把患者的腫瘤轉移到免疫缺陷小鼠獲得人源性腫瘤異種移植(PDX)的小鼠模型[12]來進行篩選。

在接種瘤株后，并沒有采用等小鼠腫瘤生長到一定程度后再給藥的方式。因為小鼠肝癌H22細胞是一種鼠源的惡性腫瘤，在小鼠體內生長極快。和接種人源瘤株不同，H22幾乎均能成功生長。本次試驗陰性對照組平均瘤重(1.605±0.415) g，也表明腫瘤生長良好。即便是細胞毒類藥物也無法抑制腫瘤最后階段的生長，此時已無法對供試品進行評價。所以需在腫瘤長至無法抑制之前，終止試驗。鼠源瘤株大多會選擇陰性對照組瘤重為1 g時做為試驗終至時間[11]。而H22在5～8 d即可長到1 g。如果采用腫瘤體積達到100～300 mm3后再給藥，會導致給藥時間短，有些藥物可能會因為給藥時間短而藥效不理想。另一方面也打算將I30用于腫瘤的早期治療，故采用了接種后馬上給藥的方式。

選擇已上市藥物作為陽性對照藥，可以比對在研藥物和已上市藥物的藥效的差異。為在研藥物市場定位提供數據支持，也同時為將來的學術推廣提供試驗數據。故本次試驗選擇了已上市的干擾素作為陽性對照藥。IFN抑制腫瘤血管生成和30肽抗腫瘤的作用機理接近，融合蛋白可以形成協同作用。I30是利用基因工程的方法將干擾素和30肽通過接頭序列(linker)連接起來的一種細胞因子重組融合蛋白，不僅可以提高兩者的治療效果。而且降低IFN的使用量，降低使用IFN帶來的副作用。