大鼠與鯽魚腸道內含物中微生物菌群的研究*

陳芳梅 李 偉 劉 蔚 于源華 王子琛 張鵬宇 張貴林

(長春理工大學生命科學技術學院，長春 130022)

腸道菌群數量龐大，整個基因總數約為人類的150倍， 近年來，隨著“人類微生物組計劃”、“腸道元基因組計劃”等研究項目的開展，人類對腸道菌群的關注達到了空前的高度[1-3]。 隨著對其結構和功能的不斷探索，人們發現腸道菌群與宿主健康密切相關，被認為是人體的“微生物器官”[4]。已有研究結果表明腸道微生物與肝硬化、肥胖、艾滋病，甚至是心理疾病的發生都有密切的關系[5-8]。腸道微生物與宿主之間存在著腸道微生態平衡，這種平衡一旦被打破，宿主就極易遭受各種疾病的困擾[9]。深入研究腸道微生物與腸道微生態平衡對促進人體健康以及人類和動物疾病防治等具有重要意義。

本實驗研究生存環境差異極大的兩種動物腸道不同部位中微生物的分布情況，為更深入地研究腸道健康與腸道微生物的關系以及為本課題組的毒理學實驗研究提供相關的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鯽魚(423～490)g，成年雄魚，夏季，氣溫15～30 ℃，研究對象與本課題組的腸道微生物組學研究保持一致，購買自吉林省長春市新立城彥軒養殖場。

SD 大鼠(144～164)g，7周齡，雄性，清潔級，購買自吉林大學實驗動物中心(SCXK(遼)2015-0001)。

1.2 試劑

大腸桿菌選擇培養基(EMB)、卡那霉素ELB選擇培養基[10]、乳酸桿菌選擇培養基(Lbs)、雙岐桿菌選擇培養基，蛋白胨水培養基，膽汁-七葉苷培養基，快速革蘭染色液等，購買自寶泰克生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

小型高速冷凍離心機(5424R)、電熱恒溫培養箱(DNP-9082)、電子顯微鏡(CX40)、氣浴恒溫振蕩器(THZ-92A)、50 mL容量離心機(1736R)等。

1.4 方法

1.4.1腸道內容物的獲取和菌液制備: 隨機選取3只SD大鼠處死，消毒后置于超凈臺，取出空回腸、盲腸以及結腸的腸道內容物各1 g，根據已發表文獻[11]制備腸道菌液。

隨機選取3條鯽魚處死，消毒后置于超凈臺，取出前腸、中腸 以及后腸的腸道內容物各1 g，根據已發表文獻[11]制備腸道菌液。

1.4.2菌液稀釋與平板計數: 各段腸道每克內容物菌液稀釋倍數分別是：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,涂布于各選擇培養基上，每個濃度三個重復。37 ℃恒溫培養，雙歧桿菌、乳酸桿菌37 ℃厭氧培養48 h，腸球菌、大腸桿菌37 ℃好氧培養24 h。長菌后通過菌落形態、革蘭染色、鏡檢以及各種生化反應等鑒定，并進行菌落計數，計算每克濕腸道內容物中的菌數，即CFU/g標本。

公式:CFU/g標本=X×10×稀釋倍數，(X表示計數平板菌落平均數)

1.5 統計方法

2 結果

2.1 菌落鑒定

通過對平板菌落特征、菌落形態、生化反應以及革蘭染色后(如圖1和圖2)，確定所培養菌群為雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和大腸桿菌。

圖1 部分平板培養圖注：A:雙歧桿菌；B：乳酸桿菌；C：腸球菌；D：大腸桿菌Fig.1 Part of the plate culture diagramNote: A:Bifidobacterium; B:Lactobacillus; C: Enterococcus; D:Escherichia coli

圖2 革蘭染色結果 ×1000注：A:雙歧桿菌；B：乳酸桿菌；C：腸球菌；D：大腸桿菌Fig.2 Gram staining results ×1000 Note: A:Bifidobacterium; B:Lactobacillus; C: Enterococcus; D:Escherichia coli

2.2 數據分析

大鼠不同腸段的同種菌群相比，厭氧菌(雙歧桿菌、乳酸桿菌)沿腸道向下數量遞增，且有顯著差異(P<0.05)。需氧菌(腸球菌、大腸桿菌)在盲腸內的數量較其它腸段多，且有顯著差異(P<0.05)。各腸段總菌數也沿腸道向下依次遞增。表1中不同菌群的同腸段相比，各腸段中，厭氧雙歧桿菌數量最多，其次為厭氧乳酸桿菌，二者與大腸桿菌、腸球菌數量相比有顯著差異(P<0.05)。在整個腸道中厭氧的雙歧桿菌、乳酸桿菌總數比腸球菌、大腸桿菌總數高2～3個數量級，見表1。

鯽魚不同腸段的同種菌群相比，雙歧桿菌、腸球菌以及大腸桿菌數量沿腸道向下增加。各腸段總菌數沿腸道向下也依次遞增。表2不同菌群的同腸段相比，各腸段中，厭氧的雙歧桿菌數量最多，比需氧的大腸桿菌、腸球菌數量高出1～2數量級，有明顯的統計學差異(P<0.05)。同為厭氧的乳酸桿菌數量卻比需氧大腸桿菌小1～2個數量級，與腸球菌相比，除中腸段數量相差最小，其余腸段也小1～2個數量級。整個鯽魚腸道中各菌群總數從多到少依次為雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌以及乳酸桿菌，且厭氧菌(雙歧桿菌、乳酸桿菌)總數也大于需氧菌(腸球菌、大腸桿菌)總數，見表2。

表1 SD大鼠腸道菌群計數(菌落計數轉換為lg 值，Table 1 Intestinal microflora count in SD rats(Colony count was converted to lg

注：如果數據在同一行或同一列中用不同的字母表示(a,b,c，d)，則存在顯著性差異(P<0.05)，如果同一行或同一列中有相同的字母表示(a,b,c，d)，則沒有顯著差異(P>0.05)

Note: There is significant difference (P<0.05) if the data are labeled with different letters (a,b,c，d), and no significant difference (P> 0.05) if with the sameletters (a,b,c，d) in the same line or in the same column

腸段雙歧桿菌乳酸桿菌腸球菌大腸桿菌總計前腸7.337±0.127a3.709±0.066b5.002±0.065c5.326±0.064d7.354中腸7.392±0.139a5.466±0.093d5.118±0.069b6.493±0.071c7.463后腸8.044±0.070c5.379±0.051d6.072±0.042a6.853±0.029b8.080總計8.2035.7336.1517.0218.235

注：如果數據在同一行或同一列中用不同的字母表示(a,b,c，d)，則存在顯著性差異(P<0.05)，如果同一行或同一列中有相同的字母表示(a,b,c，d)，則沒有顯著差異(P>0.05)

Note: There is significant difference (P<0.05) if the data are labeled with different letters (a,b,c,d), and no significant difference (P>0.05) if with the sameletters (a,b,c，d) in the same line or in the same column

在大鼠、鯽魚腸道中，厭氧的雙歧桿菌所占比例最多，且在鯽魚腸道中雙歧桿菌所占比例(92.76%)遠高于大鼠腸道中的相應比例(66.24%)。而同為厭氧菌的乳酸桿菌在鯽魚腸道中的比例(0.32%)遠低于大鼠腸道中的比例(33.61%)。鯽魚腸道中的需氧菌(腸球菌和大腸桿菌)在腸道總菌中所占的比例也遠高于大鼠腸道中的比例，見表3。

表3 大鼠和鯽魚腸道微生物分布比例(%)Table 3 Distribution of intestinal microflora in rats and crucian carp(%)

3 討論

已有研究表明腸道微生物在腸道不同區域的分布有所不同，以便適應不同腸段的環境或者促進其功能[12-13]。因此將大鼠和鯽魚腸道進行分段取樣，發現大鼠空回腸及鯽魚前腸段的各菌總數最少，盲腸及中腸次之，而結腸和后腸段各菌總數最高，這一結果與之前的研究是一致的，即腸道中微生物的密度沿腸道向下是逐漸增加的[14-15]。

實驗將鯽魚和大鼠腸道中各菌總數進行對比，發現大鼠腸道中乳酸桿菌所占比重遠高于鯽魚腸道，同時大鼠腸道中雙歧桿菌、腸球菌以及大腸桿菌所占比重都明顯小于鯽魚腸道。這可能是乳酸桿菌引起的，乳酸桿菌作為腸道益生菌之一，有研究表明乳酸桿菌的分泌產物能改變革蘭陽性菌細胞膜的通透性從而抑制陽性菌的生長，同時降低腸道pH，抑制大腸桿菌及梭菌等的生長[16]。實驗結果中鯽魚腸道中乳酸桿菌數量與尹軍霞等[17]發表的結果有一定差異，這可能因為溫度的原因。已有研究表明鯽魚腸道內的乳酸桿菌也會因季節變化而發生改變，主要是與溫度有關。

無論陸生哺乳動物大鼠，還是淡水卵生動物鯽魚，其各腸段中有益菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)的總數量都要明顯高于條件致病菌(腸球菌和大腸桿菌)的總數量。鯽魚、大鼠整個腸道中需氧的腸球菌的數量級相當。大鼠、鯽魚腸道中雙歧桿菌的數量沿著腸道向下是逐漸增加的，腸道總菌數也沿腸道向下逐漸增加。大鼠腸道中只有乳酸桿菌所占比重高于鯽魚腸道，其余菌落(雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌)比重都明顯小于鯽魚腸道。通過本實驗揭示了不同動物的不同腸段中腸道微生物的分布呈現各自的規律，為深入研究腸道健康與腸道微生物之間關系提供理論信息。