酸誘導(dǎo)對大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系凝膠特性的影響

劉圣雅，彭媛媛，張甫生，鄭炯*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715)

大豆蛋白是目前唯一含有9種必需氨基酸且含量滿足人體需求的一種植物蛋白，常作為一種普遍廉價的蛋白資源[1]。大豆蛋白在食品中的應(yīng)用不僅依賴于其營養(yǎng)性，更依賴于其功能特性，如起泡性、乳化性、溶解性、凝膠性等。其中，凝膠性是大豆蛋白最重要的功能特性之一[2]。但是大豆蛋白凝膠的功能特性受加工條件的影響較大，如蛋白質(zhì)濃度、加工溫度、加工時間、pH值等[3]。

為提高大豆蛋白凝膠的穩(wěn)定性，一般采用添加大分子多糖的方法。研究表明，大豆蛋白與魔芋膠[4]、葡聚糖[5]的交聯(lián)作用有明顯的協(xié)同增稠效應(yīng)；大豆蛋白與殼聚糖和海藻酸鈉的復(fù)合體系較大豆蛋白而言，溶解性、乳化性和熱穩(wěn)定性均有明顯提高[6]。高酯果膠是來源豐富的天然水溶性多糖，主要成分是D-聚半乳糖醛酸[7]，其所帶的負電荷能夠與大豆蛋白表面的正電荷相結(jié)合，通過靜電作用力的驅(qū)動形成可溶性聚合物[8]，高溫下可與大豆蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)[9]，形成大分子擁擠體系，使大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)更加有序致密。適量的高酯果膠對大豆蛋白有一定的修飾作用，可以顯著改善大豆蛋白的凝膠強度，提高凝膠持水能力[10]。

酸性條件廣泛存在于食品加工和生產(chǎn)過程中，因此研究酸性條件對蛋白/多糖復(fù)合體系凝膠特性的影響具有重要意義。大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的交聯(lián)作用主要由靜電相互作用力驅(qū)動[11]，pH值會顯著影響其相互作用的過程。在復(fù)合體系的酸化過程中，酸化速率是決定其凝膠特性及微觀結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素[12]，但目前對于大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系受酸性條件的影響還鮮有報道。因此，本實驗以大豆蛋白和高酯果膠為原料，通過添加不同濃度的葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)作為酸誘導(dǎo)劑，考察pH對復(fù)合體系流變特性、質(zhì)構(gòu)特性、Zeta電位和微觀結(jié)構(gòu)的影響，探討復(fù)合體系在特定pH條件下的凝膠特性，以期為大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系在酸性條件下的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白(食品級，蛋白質(zhì)含量為92%)，深圳一諾食品配料有限公司；高酯果膠(食品級，酯化度：65%)，廣州鴻易食品添加劑有限公司；葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL，食品級)，鄭州食全食美商貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A電子分析天平，上海精天電子儀器有限公司；pHS-3C酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀，美國TA公司；CT3物性測定儀，美國Brookfield公司；Nano-ZS&MPT-2 Zeta電位及納米粒度儀，英國Malvern公司；JSM-6510LV鎢燈絲掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社(JEOL)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

參考張靜等[13]的方法，加以調(diào)整。在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選定大豆蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L，高酯果膠質(zhì)量濃度為6 g/L，制備復(fù)合體系樣品，使其不過分黏稠，又保證了一定的蛋白質(zhì)濃度，在生產(chǎn)中具有實際意義。將大豆分離蛋白溶于pH=7.0的去離子水中，在25 ℃下攪拌20 min使之溶解完全，80 ℃ 下加熱使蛋白質(zhì)變性，待溶液澄清后，向大豆蛋白分散液中緩慢加入高酯果膠溶液，加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH為7.0， 繼續(xù)加熱溶解30 min，得到均勻的混合液。將混合液靜置冷卻到室溫(20～40 ℃)后，用GDL溶液調(diào)節(jié)至特定pH，攪拌2 min后靜置加熱30 min，等待凝膠形成，將復(fù)合體系樣品在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 流變特性的測定

參考畢崇浩[14]的方法并稍作修改，用一次性滴管吸取適量樣品置于平板上，在表面涂一層硅油以防止樣品水分的蒸發(fā)，采用平板-平板測量系統(tǒng)，平板直徑40 mm，設(shè)置間隙1 mm。

動態(tài)黏彈性測定:設(shè)定溫度25 ℃，掃描應(yīng)變1%，測量前樣品先靜置平衡5 min，應(yīng)力為0.5%，測定由低頻率(0.1 Hz)至高頻率(10 Hz)內(nèi)儲能模量(G′)、損耗模量(G″)及損耗角正切值(tanδ=G″/G′)隨角頻率的變化。

動態(tài)時間掃描測定:設(shè)定溫度25 ℃，頻率為0.5 Hz， 掃描應(yīng)變1%，確保樣品在線性黏彈區(qū)內(nèi)進行試驗，測定1 h內(nèi)樣品儲能模量(G′)和損耗模量(G″)的變化。

動態(tài)溫度掃描測定:溫度以2 ℃/min的升溫速率從25 ℃升高至80 ℃，在80 ℃下保持15 min后，以5 ℃/min的速率從80 ℃下降至25 ℃，其中應(yīng)變?yōu)?%，頻率為1 Hz，記錄儲能模量(G′)、損耗模量(G″)隨時間和溫度的變化情況。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性的測定

采用CT3物性測定儀對樣品進行質(zhì)地剖面分析(TPA)測定。設(shè)置以下參數(shù)：探頭P/0.5；測前速度1.00 mm/s； 測試速率1.00 mm/s；返回速度1.00 mm/s；觸發(fā)力20.0 g；壓縮形變程度20%。每組測試均做3次平行測定，實驗結(jié)果為平均值。

1.3.4 Zeta電位的測定

吸取50 μL樣品溶液于25 mL容量瓶中，加入去離子水定容，將樣品溶液稀釋500倍后采用Malvern納米粒度儀測定不同pH下復(fù)合體系的Zeta電位。測定條件如下[15]：比色池規(guī)格為1 cm聚苯乙烯池，用一對0.45 cm2鉑電極，距為0.4 cm。測定溫度為25 ℃，平衡時間2 min。每組包含10到50次測量，依數(shù)據(jù)重現(xiàn)性而定，計算3次重復(fù)得到平均值為測定值。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考于翠柳[16]的方法加以調(diào)整，將樣品置于培養(yǎng)皿中，放入冰箱凍藏24 h，然后在-50 ℃下真空冷凍干燥72 h，取出后用手術(shù)刀在干燥好的凝膠中部取樣，切割成(5×5×10) mm的長條狀后進行噴金處理，用掃描電子顯微鏡觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)，在15 kV的加速電壓和500倍的放大率下進行觀察和拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3次，每次測試均需重新制備樣品。文中所有圖表均使用Origin 9.1和Microsoft Excel進行繪制，利用SPSS 19.0對質(zhì)構(gòu)特性以及Zeta電位數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對復(fù)合體系流變特性的影響

2.1.1 動態(tài)黏彈流變特性

圖1-A為復(fù)合體系儲能模量G′隨角頻率變化曲線圖，圖1-B為復(fù)合體系損耗模量G″隨角頻率變化曲線圖。

A-儲能模量;B-損耗模量圖1 復(fù)合體系儲能模量G′與損耗模量G″隨角頻率變化曲線Fig.1 Curves of dynamic modulus with angular frequency of composite system

由圖1可見，復(fù)合體系的G′和G″隨著pH的升高的而呈現(xiàn)出上升趨勢，在pH=5.0時達到最大值，此時復(fù)合體系內(nèi)部存在較強的靜電相互作用力，擁有最佳的凝膠強度[17]。當pH繼續(xù)升高，G′和G″迅速降低，說明當復(fù)合體系的pH偏離等電點時，由于正負電荷不平衡，靜電相互作用的減弱，導(dǎo)致大豆蛋白與高酯果膠交聯(lián)作用減弱，凝膠強度下降。整個過程中所有組別的G′均大于G″，且表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即都隨角頻率的增加而增大，復(fù)合體系表現(xiàn)出一種顯著的膠體行為[18]。

圖2是tanδ隨角頻率變化曲線，復(fù)合體系的tanδ起初隨角頻率的增大而減小，隨后趨于穩(wěn)定，說明角頻率的增加導(dǎo)致體系的流動性減弱，彈性增強，復(fù)合體系在高頻率的震動作用下主要表現(xiàn)出彈性性質(zhì)。在pH=5.0時復(fù)合體系這一特征表現(xiàn)得最為明顯，說明樣品的固體彈性性質(zhì)最強，可賦予產(chǎn)品良好的口感。這與董蝶等[19]提出的，在pH接近蛋白質(zhì)等電點時具有相同組成的混合物呈現(xiàn)更強的彈性特性這一結(jié)論相符。

圖2 損耗正切值隨角頻率變化曲線Fig.2 Curves of tanδ with angular frequency of composite system

2.2.2 動態(tài)時間掃描

圖3為不同pH條件下復(fù)合體系的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨時間變化的曲線。G′和G″都在pH=5.0時達到最大值，這與動態(tài)黏彈性的測試結(jié)果相一致。隨著pH的降低，復(fù)合體系的流變特性發(fā)生明顯變化，當pH為3.3時，復(fù)合體系內(nèi)正負電荷分配嚴重不均衡，靜電斥力增大，難以形成固體凝膠。在時間掃描測試中，體系的G′首先出現(xiàn)輕微的浮動而后趨于穩(wěn)定，G″也具有同樣的趨勢。這可能是復(fù)合體系進入測試后，由于最初所施加的剪切力破壞了體系原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了短暫的波動，隨著時間的增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到適應(yīng)和恢復(fù)，曲線趨于穩(wěn)定。在整個測試范圍內(nèi)，G′與G″都隨時間變化而呈現(xiàn)出微弱的上升趨勢，黏彈模量對頻率表現(xiàn)出較小的依賴性，這是凝膠的典型特征，說明凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本形成[20]。動態(tài)模量曲線越平穩(wěn)，反映出的凝膠性質(zhì)越穩(wěn)定。在pH=5.0時復(fù)合體系的動態(tài)模量曲線波動性最小，受到破壞后恢復(fù)原狀的時間最快[21]，表明pH在5.0時為復(fù)合體系提供了最有利的環(huán)境因素。

A-儲能模量;B-損耗模量圖3 復(fù)合體系儲能模量G′與損耗模量G″隨時間變化曲線Fig.3 Curves of storage modulus and loss modulus of composite system with time

2.2.3 動態(tài)溫度掃描

復(fù)合體系的儲能模量G′和耗能模量G″隨溫度變化的曲線如圖4所示。

A-儲能模量;B-損耗模量圖4 復(fù)合體系儲能模量G′與損耗模量G″隨溫度變化曲線Fig.4 Curves of storage modulus and loss modulus of composite system with temperature

復(fù)合體系的凝膠現(xiàn)象是大豆蛋白與高酯果膠的長鏈分子相互交聯(lián)從而將液體纏繞固定在內(nèi)的三維連續(xù)式網(wǎng)絡(luò)[22]。溫度升高會造成分子運動速率的加快，粒子間非共價力減弱[23-24]，交聯(lián)結(jié)構(gòu)受到破壞，難以形成相對穩(wěn)定的復(fù)合體系。pH=5.0時復(fù)合體系在整個溫度變化過程中始終保持著最大的動態(tài)模量，高溫狀態(tài)下仍然表現(xiàn)出較穩(wěn)定的固體凝膠特性。這可能是由于此時體系內(nèi)部的靜電阻力和空間位阻較小，大豆蛋白分子表面帶靜電的疏水基團被包埋進分子內(nèi)部，為高酯果膠分子提供了足夠的結(jié)合位點，形成了穩(wěn)固的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠緩和高溫作用對凝膠特性造成的破壞[25]。當pH遠離大豆蛋白等電點時，體系內(nèi)的靜電相互作用失去平衡，分子間交聯(lián)位點減少，復(fù)合體系的動態(tài)模量減小，表現(xiàn)為彈性性能降低，凝膠強度降低。

2.2 pH對復(fù)合體系質(zhì)構(gòu)特性的影響

表1為大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)。凝膠的硬度主要取決于分子間交聯(lián)和纏繞的程度，復(fù)合體系的硬度隨pH的增大而增大，pH=5.0時遠遠高于其他條件下的硬度，說明在此環(huán)境條件下凝膠內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)間存在最多的交聯(lián)位點。復(fù)合體系的內(nèi)聚性決定了其黏著性[26]，這2個指標隨pH的變化表現(xiàn)出相同的趨勢，均在pH=5.0時表現(xiàn)出較高水平，而當pH進一步增大時，大豆蛋白與高酯果膠分子的靜電相互作用減小，引起復(fù)合體系內(nèi)聚力減弱，黏著性隨之下降。凝膠結(jié)構(gòu)的彈性與內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，復(fù)合體系的彈性在pH=3.3時具有最小值，可能是由于pH低于等電點時導(dǎo)致的過度酸化，復(fù)合體系內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較疏松[27]。隨著pH的升高，復(fù)合體系的彈性逐漸增大并在pH=5.0時達到最大值，這一趨勢與流變特性的測定結(jié)果一致。咀嚼性是評價凝膠食品感官性質(zhì)的重要指標，pH=5.0時復(fù)合體系的咀嚼性最大，對產(chǎn)品的口感具有有利影響，可以提高凝膠產(chǎn)品的品質(zhì)和風味。

表1 復(fù)合體系的質(zhì)構(gòu)參數(shù)Table 1 Parameters of texture profile of composite system

注：在同一列中的平均值(±標準差)所帶的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 pH對復(fù)合體系Zeta電位的影響

圖5為pH對復(fù)合體系Zeta電位的影響。由圖可知，隨著pH的增加，Zeta電位逐漸降低。在pH小于5.0時復(fù)合體系中的大豆蛋白分子和H+都帶有正電荷，此時靜電排斥力將成為主導(dǎo)[28]。當復(fù)合體系pH降低，帶正電荷的H+濃度增加，導(dǎo)致靜電斥力和空間位阻增強，不足以使蛋白質(zhì)膠束穩(wěn)定存在。在pH=4.3時，復(fù)合體系的Zeta電位絕對值最小，是由于此時大豆蛋白所帶的正電荷與高酯果膠所帶的負電荷幾乎完全結(jié)合。當pH繼續(xù)增大到5.0時，此時大豆蛋白接近高酯果膠“漂移”影響下的等電點[29]，大豆蛋白暴露在表面的極性基團包埋進分子內(nèi)部，大豆蛋白表面幾乎沒有電荷，Zeta電位主要由高酯果膠的帶電量決定，故Zeta電位表現(xiàn)為帶少量負電荷。此時的靜電相互作用會促進大豆蛋白與高酯果膠聚集產(chǎn)生大量松散相連的聚集體簇，能形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的體系。當pH繼續(xù)升高至等電點以上時，大豆蛋白帶負電荷，對于Zeta電位起到主要影響作用，隨著pH遠離等電點，Zeta電位減小。在整個變化過程中，復(fù)合體系的Zeta電位隨pH呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化趨勢，不同組別之間的Zeta電位存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 pH對復(fù)合體系Zeta電位的影響Fig.5 Effects of pH on Zeta potential of composite system

2.4 pH對復(fù)合體系微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6分別為5種pH條件下復(fù)合體系凝膠的放大500倍的微觀結(jié)構(gòu)圖。圖6-A表明pH=3.3時復(fù)合體系的微觀結(jié)構(gòu)與其他組別存在顯著性差異。其片狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)大面積坍塌，無法形成三維網(wǎng)絡(luò)，說明此時復(fù)合體系內(nèi)部的靜電相互作用極不平衡，根據(jù)Zeta電位的測量結(jié)果可知，此時體系帶有大量的正電荷，由于存在熱力學(xué)不相容，導(dǎo)致無法形成凝膠結(jié)構(gòu)[30]。隨著pH的升高(圖6-B、圖6-C)，GDL釋放出的H+吸附在大豆蛋白分子表面，降低了其表面的靜電排斥力，復(fù)合體系勾連成網(wǎng)狀，出現(xiàn)了部分條狀、網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，但分子內(nèi)部存在空洞和破損，表面粗糙，某些部位存在顆粒狀的結(jié)構(gòu)，此時的空間結(jié)構(gòu)仍然復(fù)雜無序，是復(fù)合體系凝膠特性較差的原因。

圖6-D為pH=5.0時，此時復(fù)合體系內(nèi)部進一步發(fā)生變化，由于存在良好的靜電相互作用力，結(jié)構(gòu)表面光滑，孔徑小且致密均勻，三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，形成連續(xù)性更佳的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。魏東旭等[31]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白的疏水性隨著pH的升高而減小，在pH=5.0附近時，大豆蛋白疏水性達到最小值，之后又繼續(xù)上升。大豆蛋白疏水性減小是由于原先暴露的側(cè)鏈被包埋進蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，高酯果膠可以與大豆蛋白在分子內(nèi)部形成更多的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，三維網(wǎng)絡(luò)由疏松變得緊湊穩(wěn)定。因此，此時的微觀結(jié)構(gòu)內(nèi)部孔徑表現(xiàn)得最為致密有序。當pH進一步增大時，復(fù)合體系內(nèi)的氫離子難以維持靜電平衡，大豆蛋白分子側(cè)鏈暴露，分子內(nèi)部的結(jié)合位點減少，復(fù)合體系的交聯(lián)結(jié)構(gòu)部分斷裂，排列較為無序，孔徑也再次變得不均勻。

圖6 不同pH條件下復(fù)合體系的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of composite system with different pH

3 結(jié)論

在pH為3.3～5.6內(nèi)，酸性條件對大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的凝膠特性有較大影響。當pH=5.0時，等電點附近的大豆蛋白分子存在較多的交聯(lián)位點，復(fù)合體系在靜電相互作用下形成均勻致密的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，宏觀上表現(xiàn)出最穩(wěn)定的彈性固體特性。當pH繼續(xù)降低，復(fù)合體系的流變特性和質(zhì)構(gòu)特性惡化，在pH=3.3時，過度酸化導(dǎo)致復(fù)合體系難以形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠特性遭到破壞。復(fù)合體系Zeta電位的測定，揭示了凝膠結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。研究結(jié)果可為提高大豆蛋白/高酯果膠復(fù)合體系的穩(wěn)定性和改善產(chǎn)品口感提供理論依據(jù)，拓寬其應(yīng)用范圍。