痛風與MUTYH基因rs10527342位點多態性相關性探討

蔡燕，邢苓玲，青鑫，何城，彭乙華

(川北醫學院附屬醫院，1.檢驗科；2.內分泌科；川北醫學院，3.檢驗系；4.轉化研究中心，四川 南充 637000)

痛風是一種臨床上以高尿酸血癥以及發作性關節炎、關節變形、腎臟損害、痛風結節等為主要表現的疾病，常常伴發多種疾病，如糖尿病、心肌梗塞、肥胖、腦卒中等[1]，嚴重危害患者身體健康。近年來隨著我國經濟的發展和人們生活水平的提高，原發性痛風患病率逐漸升高[2]，故有必要探討痛風的發病原因，為早期診斷和治療痛風奠定實驗室基礎。研究表明，原發性痛風與體內尿酸鹽在組織和器官中的沉積有關，高濃度的尿酸鹽可激活體內的NADPH氧化酶，使活性氧(ROS)生成增加，機體氧化/抗氧化系統失衡引起DNA損傷[3]。DNA糖基化酶MUTYH基因與DNA氧化損傷修復有關，AluYb8MUTYH變異是AluYb8插入到DNA糖基化酶MUTYH基因的第15個內含子中，可導致MUTYH基因功能異常，從而直接或間接引起疾病發生[4]。故本研究擬探討MUTYH基因AluYb8MUTYH多態性與我國漢族人群原發性痛風發病風險的相關性，為痛風的早期診斷篩選合適的遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集2014年至2016年在川北醫學院附屬醫院風濕血液科就診的183例原發性痛風患者作為研究對象[痛風組年齡(55.37±12.87)歲]，同期健康體檢者213名作為對照組年齡(53.90±9.14)歲，均收集外周血、臨床和實驗室資料，提取基因組DNA備用。其中痛風組均符合1977年美國風濕病協會制定的痛風性關節炎診斷標準。對照組排除痛風、高尿酸血癥、高脂血癥、高血壓、冠狀動脈硬化性心臟病、糖尿病、惡性腫瘤等疾病。所有納入對象均知情同意。

1.1.2 試劑和儀器 外周血基因組DNA提取試劑盒、2×mastermix、瓊脂糖均購自北京天根生化科技有限公司。PCR儀、凝膠成像儀為美國BioRad生產。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 選取文獻[4]中報道的引物序列，并在Pubmed上進行在線比對，理論上無非特異性擴增，合成引物對用于后續實驗。引物由北京博邁德生物有限公司合成，序列如下：正向引物 5′-TCTTGACCTGGAGACCTTCC-3′，反向引物 5′-AGCTGCTTCCTCCAAACAGC-3′。

1.2.2 外周血基因組DNA提取 所有患者及對照組人群均抽取EDTA抗凝外周靜脈全血2 mL。按外周血基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因DNA，分裝后置-20 ℃保存備用。

1.2.3 PCR反應 PCR反應體系為25 μL，包括2×mastermix 12.5 μL、10 μmol/L的正向引物0.5 μL、10 μmol/L反向引物0.5 μL、2 μL樣品DNA、9.5 μL去離子水，置PCR反應管中。反應條件，95 ℃預變性5 min，循環反應：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。將擴增產物置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 電泳檢測 對所有PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析：取8 μL PCR產物與1.5 μL的6× loading bufer混合，1%瓊脂糖電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓110 V，電泳時間30 min；凝膠成像儀觀察結果并拍照，記錄并分析相關基因型。

1.2.5 相關生化指標檢測 利用全自動生化分析儀，對所選樣本的血糖(serum glucose,GLU)、甘油三脂(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、尿酸(serum uric acid,UA)尿酸等相關指標進行檢測，記錄結果。

1.3 統計學分析

采用SPSS16．0數據分析軟件對獲得的數據進行處理，其中計數資料用卡方檢驗、計量資料采用t檢驗進行分析(以P<0.05表示差異有統計學意義)，各基因型及等位基因的相對危險度(odd ratio，OR)值和95%的可信區間(CI)經性別、年齡、GLU、TG、TC、UA等因素通過非條件Logistic回歸校正。

2 結果

2.1 臨床資料結果分析

痛風組和對照組間年齡、性別構成和TG差異無顯著性(P>0.05)；但兩組間UA濃度、GLU和TC之間差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 臨床資料與痛風發病風險之間的關系

2.2 AluYb8MUTYH基因插入/缺失多態性PCR擴增結果

MUTYH基因intron15插入/缺失多態性可呈現2種不同的片段，長片段為：826 bp，含AluYb8插入序列；短片段為500 bp，不含AluYb8插入序列。人群中存在3種基因型，分別為純合插入型(AluYb8 presence/presence,P/P)、純合野生型(AluYb8 absence/absence,A/A)和雜合型(AluYb8 presence/absence,P/A)。MUTYH基因AluYb8MUTYH多態性在痛風組中有167例(91.26%)、對照組中有209例(98.12%)得到有效擴增。見圖1。

2.3 AluYb8MUTYH基因插入/缺失多態性與痛風發病風險相關性

痛風組中A/A、A/P、P/P基因型頻率分別為36.53%、49.70%和13.77%，對照組中A/A、A/P、P/P基因型頻率分別為24.88%、51.67%和23.45%。對照組中各基因型的分布符合Hardy-weinberg平衡(χ2=0.237，P=0.626)；痛風組各基因型與對照組進行比較，差異有統計學意義(χ2=8.792，P=0.012)，痛風組等位基因頻率與對照組比較，差異有統計學意義(χ2=8.540，P=0.003)，其中A等位基因與痛風發病風險有關[OR=1.544，95% CI(1.153～2.088)]。見表2。

表2 MUTYH基因AluYb8MUTYH多態性在痛風患者中的分布[n(%)]

等位基因/基因型痛風組(n=167)對照組(n=209)χ2值P值OR (95%CI)基因型8.7920.012A/A61(36.53)52(24.88)A/P83(49.70)108(51.67)P/P23(13.77)49(23.45)等位基因8.5400.0031.544(1.153～2.088)A205(61.38)212(50.72)P129(38.62)206(49.28)

3 討論

原發性痛風是一種嘌呤代謝紊亂性疾病，其發病與體內尿酸鹽在組織和器官中的沉積有關，高濃度的尿酸鹽可激活體內的NADPH氧化酶，使活性氧(ROS)生成增加，機體氧化/抗氧化系統失衡，體內超氧化物歧化酶(SOD)合成減少，抗氧化能力降低[5]，導致機體發生氧化損傷，如DNA損傷。DNA糖基化酶MUTYH基因定位于染色體1p32.1至p34.3，含有16個外顯子，MUTYH基因編碼是一種特異的腺嘌呤轉葡糖基酶，在復制后切除子鏈DNA中與母鏈8-羥基鳥嘌呤(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)錯配的A。MUTYH基因AluYb8MUTYH插入/缺失基因多態性可引起低效的DNA修復和外周循環中炎癥因子IL-1水平的增加，與衰老[6]、糖尿病[7]、胃癌[8]等高度相關。故本研究擬探討DNA酶修復基因MUTYH基因AluYb8MUTYH變異與痛風發病的關系。

實驗結果顯示MUTYH基因AluYb8MUTYH在漢族人群中呈多態性分布，痛風組中有167例(91.26%)、對照組中有209例(98.12%)得到有效擴增，陰性標本可能與DNA提取不佳有關；對照組中MUTYH基因AluYb8MUTYH多態性基因型分布符合Hardy-Wernberg平衡(χ2=0.237，P=0.626)；其中痛風組中A/A、A/P、P/P基因型頻率分別為36.53%、49.70%和13.77%，對照組中A/A、A/P、P/P基因型頻率分別為24.88%、51.67%和23.45%；痛風組各基因型與對照組進行比較，差異有統計學意義(χ2=8.792，P=0.012)，痛風組等位基因頻率與對照組比較，差異有統計學意義(χ2=8.540，P=0.003)，其中A等位基因在痛風組中比例較高[OR=1.544，95%CI(1.153～2.088)]，提示A等位基因與痛風發病風險密切相關。

氧化應激(oxidative stress,OS)指體內遭受有害刺激時體內高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基等產生過多，氧化和抗氧化系統失衡，導致脂類、蛋白質和核酸等結構和功能改變，從而引起DNA鏈斷裂、DNA位點突變等DNA損傷[9]。本研究還發現痛風組的TC、GLU明顯高于對照組，提示痛風患者體內存在血脂和血糖紊亂，王雪嬌等[10]研究結果顯示原發性痛風患者存在脂質代謝紊亂，N-HDL-C、TC、TG和LDL均比對照組明顯增加，而HDL明顯降低。過氧化的脂質在生物體內積聚，可以破壞細胞的結構和正常生理功能，對生物體最大的損害就是引發DNA損傷，當DNA損傷發生后，機體可開啟修復功能，通過光修復、切除修復、重組修復、SOS修復等方式對損傷進行修復[11]。如果修復成功，DNA結構可能恢復而重新執行其功能；當修復失敗，發生DNA損傷的細胞可能發生死亡或基因突變，使得細胞獲得新的功能或進化。

雖然其它研究表明MUTYH基因AluYb8MUTYH多態性中P等位基因與衰老、糖尿病和腫瘤等有關，但本實驗結果顯示痛風患者的MUTYH基因AluYb8MUTYH多態性中P等位基因頻率(38.62%)低于對照組(49.28%)，提示痛風患者體內雖然存在DNA損傷，但其急性發作可能與之關系不大；而A等位基因的頻率(61.38%)高于對照組(50.72%)，研究[12]顯示痛風的急性發作與淋巴細胞、單核-巨噬細胞等炎性細胞分泌IL-6、TNF-a等有關，分析可能攜帶A等位基因的痛風患者的DNA損傷修復能力較強，使炎性細胞功能恢復，分泌炎性細胞因子，參與痛風性炎癥的發生發展，引起痛風急性發作。