苯甲磺酰截短側耳素國家對照品的研制

韓寧寧，戴青，趙暉，楊秀玉

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

延胡索酸泰妙菌素是截短側耳素類半合成的動物專用抗生素。苯甲磺酰截短側耳素是合成延胡索酸泰妙菌素的中間體。《中國獸藥典》2015年版一部收載了延胡索酸泰妙菌素及其可溶性粉與預混劑[1]。在原料及制劑的含量測定過程中，均需將延胡索酸泰妙菌素對照品與苯甲磺酰截短側耳素對照品混合配制為系統適用性對照品溶液以測定系統適用性。

經查詢，目前僅USP有該對照品供應，但價格昂貴，購買周期長。國家獸藥基礎信息查詢系統[2]顯示，目前泰妙菌素及其制劑的有效期內批準文號共600個，其中原料文號10個，預混劑文號293個，可溶性粉文號297個。如此眾多的企業在泰妙菌素含量測定過程中均需使用苯甲磺酰截短側耳素對照品進行系統適用性檢查。然而，調研發現，在企業內部質量控制過程中，多使用自行生產的苯甲磺酰截短側耳素原料充當系統適用性工作對照品，該原料無相應質量標準對其純度進行控制。因此，研制苯甲磺酰截短側耳素國家對照品對于延胡索酸泰妙菌素原料及制劑的生產及質量控制具有重要意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備 四級桿質譜儀(Waters XEVO TQD)；高效液相色譜儀(HPLC)(Waters e2695色譜系統，Empower 3色譜工作站)；二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 藥品與試劑 溯源對照品來源/批號：USP/F0C328；苯甲磺酰截短側耳素原料藥來源：山東勝利生物工程有限公司。甲醇和乙腈(MERCK公司色譜純試劑)。其余試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 分子量測定 分別取苯甲磺酰截短側耳素原料與對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并配制為10 μg/mL的溶液直接進樣。離子源為ESI源，正離子全掃描模式(ESI+)。毛細管電壓3.0 kv，錐孔電壓30 kv，脫溶劑溫度350 ℃。掃描范圍m/z100～1000 Da，采集速率1.5 spectra/s。

2.2 鑒別

2.2.1 液相鑒別 照純度檢查項下的色譜條件，取該檢查項下的供試品溶液與對照品溶液進樣，采集色譜圖，考察供試品溶液主峰與對照品溶液主峰出峰時間是否一致，紫外光譜圖是否一致。

2.2.2 紅外鑒別 參考《中國獸藥典》2015年版一部延胡索酸泰妙菌素質量標準[1]中紅外鑒別方法，取苯甲磺酰截短側耳素原料與對照品適量，采用溴化鉀壓片法制片，采集4000～400 cm-1波段紅外光譜圖，考察二者是否一致。

2.3 純度測定 采用《中國獸藥典》2015年版一部 延胡索酸泰妙菌素質量標準[1]中含量測定項下的色譜條件測定純度，考察其純度是否符合《獸藥標準品、對照品、對照藥材質量標準》[3]中關于定位用對照品純度不得低于90.0%的規定。十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；二極管陣列檢測器，檢測波長為212 nm，同時在200～400 nm波長范圍內記錄光譜圖。以甲醇-碳酸銨溶液[取碳酸銨10 g，加水800 mL使溶解，加6%高氯酸溶液(取高氯酸8.5 mL，加水至100 mL，搖勻)24 mL，用水稀釋至1000 mL，搖勻，濾過]-乙腈(49∶28∶23)為流動相；流速為1.2 mL/min。分別取延胡索酸泰妙菌素對照品和苯甲磺酰截短側耳素對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成每1 mL各約含0.08 mg的混合溶液，作為系統適用性溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，泰妙菌素峰與苯甲磺酰截短側耳素峰的分離度應大于2.0，理論板數按泰妙菌素峰計算不低于10000。取苯甲磺酰截短側耳素原料適量，用流動相溶解并稀釋制成每1 mL約含0.08 mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。按面積歸一化法計算苯甲磺酰截短側耳素的純度。

3 結果與分析

3.1 分子量 苯甲磺酰截短側耳素原料分子離子峰[M+Na]+為555.19 Da，參見圖1。USP溯源對照品分子離子峰[M+Na]+為555.18 Da，參見圖2。二者分子量一致。

3.2 鑒別

3.2.1 液相鑒別 在純度檢查項下，212 nm波長下的色譜圖中，苯甲磺酰截短側耳素原料色譜圖中主峰與對照品溶液主峰保留時間一致，且為單一物質峰(純度角度小于純度閾值)；在200 ～400 nm的波長范圍內，兩者紫外光譜圖匹配(匹配角度小于匹配閾值)，最大吸收波長一致，可判定二者為相同物質(圖3～圖4)。

圖1 苯甲磺酰截短側耳素原料質譜圖Fig 1 The MS spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

圖2 苯甲磺酰截短側耳素USP對照品質譜圖Fig 2 The MS spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

圖3 苯甲磺酰截短側耳素USP對照品光譜指數圖Fig 3 The HPLC spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

圖4 苯甲磺酰截短側耳素原料光譜指數圖Fig 4 The HPLC spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

3.2.2 紅外鑒別 苯甲磺酰截短側耳素原料紅外光吸收圖譜與對照品一致(圖5～圖6)。

圖5 苯甲磺酰截短側耳素USP對照品紅外光譜圖Fig 5 The IR spectrum of Tosyl Pleuromutilin USP reference

圖6 苯甲磺酰截短側耳素原料紅外光譜圖Fig 6 The IR spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

3.3 純度測定 溶劑空白、系統適用性及苯甲磺酰截短側耳素原料色譜圖參見圖7～圖9。2個檢驗員各進樣一份，每份重復進樣2次。純度結果見表1。平均純度為99.7%，符合不低于90.0%的規定。

圖7 溶劑空白色譜圖Fig 7 The spectrum of solvent

圖8 系統適用性色譜圖Fig 8 The spectrum of system applicability

圖9 苯甲磺酰截短側耳素原料色譜圖Fig 9 The spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

純度1/%純度2/%檢驗員199.7199.76檢驗員299.6399.68平均99.7

4 討論與結論

4.1 純度測定中色譜系統的選擇 采用高效液相色譜法測定樣品的純度，一般需至少測定2種不同類型的色譜系統中的純度，并將結果進行綜合考量與計算。但由于苯甲磺酰截短側耳素對照品僅在延胡索酸泰妙菌素含量測定過程中作為系統適用性對照品使用，故沒有考察其他色譜系統純度的必要性。因此，在本試驗設計過程中，純度測定的色譜系統僅選擇了延胡索酸泰妙菌素的含量測定色譜系統。

4.2 單一波段下計算得出的純度結果是否可以反映樣品的色譜純度 上述純度結果為212 nm波長下面積歸一化法計算的結果。同時采集了供試品3D色譜圖(圖10)，發現除溶劑空白峰外，供試品僅在7.6 min附近有雜質，該雜質最大吸收亦接近212 nm。故212 nm下的純度結果可以反映供試品的色譜純度。

圖10 苯甲磺酰截短側耳素原料3D色譜圖Fig 10 The 3D spectrum of Tosyl Pleuromutilin material

通過考察紅外、分子量、純度等關鍵質控項目，研制了苯甲磺酰截短側耳素國家對照品，可作為系統適用性對照品，用于延胡索酸泰妙菌素及其制劑含量測定的系統使用性檢查。