犬腺病毒(Ⅱ型)陽性血清的研制及應用

趙煒，孫淼，薛青紅，陳延飛，韓爽，印春生

(中國獸醫藥品監察所，北京 10081)

犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)屬于腺病毒科哺乳動物病毒屬，犬腺病毒是哺乳動物中致病性最強的病毒之一，分為兩型，Ⅰ型犬腺病毒引起犬傳染性肝炎和狐貍腦炎，Ⅱ型犬腺病毒引起犬傳染性喉氣管炎和腸炎[1]。在我國犬腺病毒病感染十分普遍，犬不分品種、年齡和性別均可發生，犬科其它動物感染也十分廣泛，如狐貍、狼等。

近幾年我國新研制并批準了多個不同毒株生產的犬腺病毒相關獸用弱毒活疫苗，如犬五聯活疫苗、狐貍腦炎活疫苗等。上述含犬腺病毒組分的獸用弱毒活疫苗產品的質量檢驗(外源病毒檢驗、鑒別檢驗、效力檢驗等)均需使用犬腺病毒陽性血清[2-3]。但是，目前我國尚無標準化、商品化的犬腺病毒陽性血清供應，評價機構和生產企業均使用非標定、非標準、非商品化的犬腺病毒陽性血清進行質量檢驗，給疫苗的質量安全帶來了極大隱患。開展標準化的犬腺病毒陽性血清研究非常重要。

中國獸醫藥品監察所以自身鑒定和保存的犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)的MDCK細胞適應毒為材料，對免疫動物、免疫佐劑和免疫程序進行深入優化和創新，成功研制犬腺病毒(Ⅱ型)陽性血清，并對其實際應用場景進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 犬腺病毒Ⅱ型弱毒(2RZ株)由山東齊魯動物保健品有限公司提供，犬腺病毒Ⅱ型弱毒(XN3株)由楊凌綠方生物工程有限公司提供，犬腺病毒I型病毒、犬腺病毒Ⅱ型病毒、犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒，牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒，均由中國獸醫藥品監察所鑒定、保存。

1.1.2 實驗動物 未免疫過任何腺病毒相關疫苗的6月齡健康易感山羊，購自北京門頭溝某養殖場。

1.1.3 血清 狂犬病病毒陽性血清、犬瘟熱病毒陽性血清、犬副流感病毒陽性血清、犬細小病毒陽性血清，均由中國獸醫藥品監察所鑒定、保存。

1.1.4 細胞和培養基 貓腎細胞(CRFK)、犬腎細胞(MDCK)、Vero細胞、MDBK細胞均由中國獸醫藥品監察所提供，MEM細胞營養液和胎牛血清購自美國Hyclone生物化學制品(北京)有限公司。

1.1.5 疫苗 狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)，由山東齊魯動物保健品有限公司生產，犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒病、細小病毒病五聯活疫苗由楊凌綠方生物工程有限公司生產，狐貍腦炎活疫苗(CAV-2C株)由吉林特研生物技術有限責任公司生產。

1.1.6 其他 15 mL 30 KD超濾濃縮管購自Millipore公司，PEG6000購自Merck公司， MontanideTMGel 01 ST佐劑購自法國Seppic公司，兔抗羊IgG H&L(FITC)二抗購自abcom公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物的篩選 經頸靜脈采集山羊血清，選擇犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病病毒抗體均為陰性且無牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒污染的6月齡健康山羊用于血清制備。

1.2.2 病毒液的制備

1.2.2.1 基礎病毒液的制備 取犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)的細胞適應毒接種已長成單層的MDCK細胞，37 ℃培養96～120 h，收獲病毒液反復凍融三次后，作為生產毒種。將生產毒種按2%比例接種MDCK細胞單層，37 ℃吸附1 h，補加維持液，37 ℃連續培養120 h，收獲后反復凍融3次，12000 r/min離心30 min去除細胞碎片。將病毒液與50%的PEG6000等體積混合后，12000 r/min超濾離心1 h后，將沉淀用原毒液1/10體積的MEM細胞營養液復溶。用MDCK細胞進行病毒含量測定，按參考文獻[6]進行。-20 ℃保存，備用。

1.2.2.2 基礎免疫病毒液的制備 將MontanideTMGel 01 ST 水性佐劑按10%的比例與基礎病毒液混合制成基礎免疫病毒液，現用現配。

1.2.2.3 加強免疫病毒液的制備 將β-丙內脂按1/8000的比例加入基礎病毒液中，4 ℃過夜滅活病毒。第二日37 ℃水浴2 h滅活β-丙內脂。將MontanideTMGel 01 ST 水性佐劑按10%的比例與滅活后的基礎病毒液混合制成基礎免疫病毒液，4 ℃保存，備用。

1.2.3 免疫和采血 將基礎免疫病毒液分別經頸部肌肉注射接種2只山羊，2 mL/只，進行基礎免疫。21 d后將加強免疫病毒液頸部肌肉注射接種2只山羊，2 mL/只，進行加強免疫。14 d后再按照與前次加強免疫相同劑量和接種途徑加強免疫一次。14 d后頸動脈采血致死，分離血清，10000 r/min離心30 min，并用0.45 μm濾器過濾除菌，凍干后待檢。

1.2.4 血清檢定

1.2.4.1 無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗 按參考文獻[5]進行。

1.2.4.2 特異性檢驗 采用微量細胞中和試驗法測定抗狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬副流感病毒的中和抗體，按參考文獻[5]進行。

1.2.4.3 效價測定 采用微量細胞中和試驗法測定血清中和抗體效價，血清制備實驗室為主檢室，并組織中國農業科學院特產研究所、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、山東齊魯動物保健品有限公司三家具有標準物質效價標定經驗的實驗室參與協作標定，按參考文獻[5]進行。將四家實驗室測定中和抗體效價計算算術平均值作為該特異性陽性血清的中和抗體效價。

1.2.5 血清在含犬腺病毒組分的生物制品及生產用疫苗株檢驗中的應用試驗 使用制備的陽性血清對2個不同批次的狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)、3個不同批次的犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒病、細小病毒病五聯活疫苗和3個不同批次的狐貍腦炎活疫苗(CAV-2C株)共8批含犬腺病毒組分的生物制品按照各自的質量標準[2-4,6]進行外源病毒檢驗和與CAV血清有關的鑒別檢驗。使用制備的陽性血清對3株犬腺病毒Ⅱ型疫苗株(CAV-Ⅱ(XN3株)、CAV-Ⅱ(BJ株)和CAV-Ⅱ(2RZ株))分別進行外源病毒檢驗[6]。

1.2.6 血清對不同的犬腺病毒毒株的中和指數測定 對3株犬腺病毒Ⅱ型疫苗株(CAV-Ⅱ(XN3株)CAV-Ⅱ(2RZ株)和CAV-Ⅱ(BJ株))，各分2組進行10倍系列稀釋，將其中一組用制備的陽性血清進行中和，另一組加入等量生理鹽水作為對照。接種已長成單層MDCK細胞的96孔細胞培養板，每組每個稀釋度接種8孔，每孔100 μL。根據MDCK細胞的細胞病變孔數按Reed-Muench法計算TCID50，并計算中和指數。比較制備的陽性血清對不同犬腺病毒毒株的中和能力。

1.2.7 血清在間接細胞免疫熒光試驗中的應用 將3株犬腺病毒Ⅱ型疫苗株(CAV-Ⅱ(XN3株)CAV-Ⅱ(2RZ株)和CAV-Ⅱ(BJ株))均稀釋至100 TCID50，分別接種已長成單層MDCK細胞的96孔細胞培養板，培養96～120 h后丙酮固定。將制備的陽性血清進行1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200稀釋，每個稀釋度的血清分別加入不同腺病毒疫苗株培養的細胞板作為一抗，并在孵育兔抗羊IgG H&L(FITC)二抗后進行熒光觀察。

2 結 果

2.1 免疫程序的探索及抗血清的制備 對生產毒種進行120 h連續培養后，收獲病毒液200 mL。通過離心法去除犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)的MDCK細胞適應毒株基礎病毒液中的細胞碎片，再經超濾濃縮、聚乙二醇沉淀后，收獲18 mL基礎病毒液，CAV-Ⅱ病毒含量達到109.0TCID50/mL。制備10 mL的基礎免疫病毒液和10 mL的加強免疫病毒液。選擇2只健康易感山羊，進行1次基礎免疫和2次加強免疫后，犬腺病毒抗血清中和抗體效價達到預期(血清中和抗體效價期望值為≥1∶1024[2-3])。采集血液制備抗血清3000 mL，并凍干保存。

2.2 血清特異性檢定結果 應用微量細胞中和試驗法對制備血清的特異性進行檢測，未檢出犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬細小病毒和狂犬病病毒的抗體(表1)，表明該血清具有良好的特異性。

2.3 血清抗體效價測定結果 血清中和抗體效價測定結果見表2。根據四家實驗室測定結果，確定血清中和抗體效價平均值為1∶9581。

表1 血清特異性檢驗結果Tab 1 Results of specificity test

SN:血清中和試驗

SN: Serum neutralization test

表2 血清中和抗體效價測定結果Tab 2 Results of neutralization titer assessment

2.4 血清在檢驗中的應用結果 分別按照狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)、犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒病、細小病毒病五聯活疫苗和狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)的質量標準對三種生物制品進行外源病毒檢驗和鑒別檢驗中與CAV血清有關的部分。按照《中國獸藥典》的規定對CAV-Ⅱ(XN3株)、CAV-Ⅱ(BJ株)和CAV-Ⅱ(2RZ株)三株疫苗株進行外源病毒檢驗。結果表明，應用制備的犬腺病毒陽性血清可以很好的應用于三種活疫苗產品和三種生產用疫苗株的質量檢驗工作。結果見表3。

2.5 對不同的犬腺病毒毒株的中和指數測定結果

制備的犬腺病毒陽性血清對三株CAV-Ⅱ疫苗株的中和指數分別為106.0、106.7、106.0，表明陽性血清對三株CAV-Ⅱ疫苗株中和能力顯著且無明顯差異。結果見表4。

表3 血清在檢驗中的應用試驗結果Tab 3 Results of application of antiserum in CAV products inspection

Y:按照產品質量標準進行檢驗，結果符合規定；"/":代表無此項目或未進行此項檢驗

Y: Test result is in compliance with respective quality standards; /: No this item

表4 CAV毒株的病毒含量測定結果及中和指數計算Tab 4 Results of Virus content and neutralization index assessment of various CAV strains

2.6 血清在間接細胞免疫熒光試驗中的應用結果 通過將制備的陽性血清進行不同稀釋度的稀釋進行間接細胞免疫熒光染色，確定對于不同的犬腺病毒毒種，制備的陽性血清均在1∶800稀釋時可達到最好的熒光染色效果。結果見圖1。

A、G：CAV-Ⅱ(XN3株)組，血清1∶800稀釋；B、H：CAV-Ⅱ(2RZ株)組，血清1:800稀釋；C、I：CAV-Ⅱ(BJ株)組，血清1∶800稀釋；D、J：CAV-Ⅱ(XN3株)組，血清1∶1600稀釋；E、K：CAV-Ⅱ(2RZ株)組，血清1∶1600稀釋；F、L：CAV-Ⅱ(BJ株)組，血清1∶1600稀釋A、B、C、D、E、F表示熒光染色；G、H、I、J、K、L表示細胞固定前普通光鏡觀察A、G：CAV-Ⅱ(Strain XN3) group，1∶800 serum dilution；B、H：CAV-Ⅱ(Strain 2RZ)group，1∶800 serum dilution；C、I：CAV-Ⅱ(Strain BJ)group，1∶800 serum dilution；D、J：CAV-Ⅱ(Strain XN3) group，1∶1600 serum dilution；E、K：CAV-Ⅱ(Strain 2RZ)group，1∶1600 serum dilution；F、L：CAV-Ⅱ(Strain BJ)group，1∶1600 serum dilutionA、B、C、D、E、F represent fluorescent staining；G、H、I、J、K、L represent observation before cell fixation圖1 MDCK細胞接種不同犬腺病毒毒種后細胞病變觀察及間接免疫熒光觀察Fig 1 CPE and indirect immunofluorescence observation of MDCK cells infected by different CAV-Ⅱ strain

3 討論與小結

陽性血清是菌毒種及活疫苗檢驗中最重要的標準物質之一，無論外源病毒檢驗、特異性檢驗、鑒別檢驗、效力檢驗，特異性均是對陽性血清的首要要求。為了滿足特異性要求，制備血清時選擇了與犬種屬關系較遠的山羊作為免疫靶動物，降低了犬源病毒污染的概率，并且在篩選時嚴格選擇無犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬細小病毒、狂犬病病毒等主要犬源病毒血清中和抗體的山羊，在血清制備完成后再次對上述病毒血清中和抗體進行了檢定，充分保證了血清優良的特異性。

免疫原處理和免疫程序是獲得較高抗體效價的關鍵。制備血清所使用的犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)通過MDCK細胞連續傳代獲得了對MDCK細胞良好的適應性，并在收獲基礎病毒液后進行PEG沉淀和超濾濃縮，以此確保免疫原的抗原性、穩定性和濃度。使用動物專用的MontanideTMGel 01 ST水性疫苗佐劑，可以極大提高免疫效果[7]。在動物免疫階段，動態監測犬腺病毒Ⅱ型血清中和抗體效價水平，確保血清制備結果可控。三所具有標準物質標定經驗的實驗室對制備血清協作標定中和抗體效價，證實了遠高于期望值的血清效價。

狐貍腦炎活疫苗(CAV-2RZ株)、狐貍腦炎活疫苗(CAV-2C株)和犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒病(XN3株)、細小病毒病五聯活疫苗三種不同的含CAV-Ⅱ型弱毒株組分的活疫苗產品，生產毒株不同且免疫動物種類不同，目前在市場上均已得到普遍應用。鑒于目前絕大多數犬腺病毒活疫苗產品均為CAV-Ⅱ型弱毒活疫苗[8-9]，故上述三種活疫苗產品可以很好的代表目前市場上的犬腺病毒類生物制品。生產用毒株的檢驗是生產合格的疫苗產品的關鍵環節，也是生物制品規程的重要規定。因此應用制備的犬腺病毒陽性血清對于上述幾種代表性疫苗株和活疫苗產品進行檢驗并取得理想檢驗效果，可以很好的驗證陽性血清的實際應用性能。中和指數測定也證實，制備的陽性血清不管對制備血清所使用的CAV-Ⅱ(BJ株)還是生產活疫苗所使用的CAV-Ⅱ(XN3株)和CAV-Ⅱ(2RZ株)均具有高效且相似的中和能力。間接細胞免疫熒光試驗除了可以佐證血清高效且特異的中和能力外，還可發現在無CPE的情況下，仍然可以觀察到明顯的熒光信號，說明了用制備的陽性血清作為一抗進行CAV病毒含量測定或血清的CAV中和抗體效價測定等試驗，可顯著提高試驗的靈敏度和精度。

獸用生物制品國家標準物質是國家負責標定和供應的用于獸用生物制品質量檢驗的標準物質，是提高獸用生物制品檢驗水平的重要環節。犬腺病毒陽性血清的制備和標定嚴格按照獸用生物制品國家標準物質相關規定[5]進行，并對血清效價這一主要特性值進行了協作標定，為犬腺病毒陽性血清國家標準物質的建立提供了重要基礎。

研究表明，緊急預防犬腺病毒感染時可緊急接種高效價免疫血清[8]。國內也有應用高免血清進行治療的報道[10]。制備的CAV血清中和抗體效價較高，中和能力優秀，能起到預防和治療的作用，將為犬腺病毒疫區的緊急預防和治療提供更好的思路。