酒石酸沃尼妙林的制備和評價

朱馨樂，徐士新，趙琪，黃耀凌，李建,趙暉，李丹，孫雷

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

沃尼妙林(Valnemulin)是20世紀90年代中期正式上市的一種動物專用抗生素，屬第二代截短側耳素類(Pleuromutilin)半合成抗生素[1-3]。具有毒性低、抗菌活性強、抗菌譜廣、代謝快、不易產生耐藥菌株、不易導致體內藥物蓄積殘留等優點，主要用于豬、牛、羊及家禽的支原體病和革蘭氏陽性菌感染疾病的防治[4-8]。1999年歐共體批準沃尼妙林用于預防與治療豬痢疾鉤端螺旋體感染引起的和由肺炎支原體感染引起的豬地方性肺炎，2004年，批準預防由結腸菌毛樣短螺旋體感染引起的豬結腸螺旋體病和治療由細胞內勞森菌感染引起的豬增生性腸病。沃尼妙林以鹽酸沃尼妙林鹽形式應用在獸醫臨床領域，但鹽酸沃尼妙林極易水解，對溫度和光照敏感，儲存穩定性較差，需采用流化床工藝制備成顆粒劑使用，在制粒過程中會有1/3～1/2的有效成分損失[9-10]。在動物口服給藥時，由于適口性差、刺激性強而影響采食，不利于達到預期的治療效果[11-12]。因此，急需開發新的適用于獸醫臨床的應用形式。

本研究提出了一種沃尼妙林酒石酸鹽的制備方法，理化性質研究表明酒石酸沃尼妙林有良好的晶形，性質穩定，易于儲存；生產制劑時，不需專用的高溫高壓設備，通過與飼料簡單混合即可制成預混劑，而且在制備過程中能避免有效成分的損失；在口服時，晶態鹽由于改良了適口性而更容易被動物接受，擴展了沃尼妙林在獸醫臨床上的應用范圍(圖1)。

圖1 酒石酸沃尼妙林分子結構式Fig 1 Structure of valnemulin hydrogen tartrate

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 D8 ADVANCE XD-3 X-射線粉末衍射儀(德國Bruke公司)；Phillips XL30 SEM-FEG掃描電子顯微鏡(荷蘭Eindhoven公司)； Waters 2695高效液相色譜儀，配UV檢測器(美國Waters公司)；AG-285電子天平(瑞士 Metteler公司)。

1.2 試劑與藥品 沃尼妙林為康倍德化學品有限公司制備(含量95.92%)；鹽酸沃尼妙林來源為龍翔公司(含量96.30%，生產日期：201005)；N, N-二甲基乙酰胺、酒石酸均為分析純；乙腈、甲醇為色譜純，德國默克公司；水為超純水；酒石酸沃尼妙林標準品來源為Dr.Ehrenstorfer GmbH公司(含量98.70%，批號：Y0000533)。

1.3 酒石酸沃尼妙林的制備 在室溫的條件下，將8 g沃尼妙林溶于50 mL乙腈與N, N-二甲基乙酰胺(60∶40，V/V)組成的混合溶劑中，然后將1.6 g酒石酸加到沃尼妙林溶液中，在溫度60 ℃的條件下反應2.0 h，直至該反應液澄清，讓反應液冷卻至室溫，結晶，過濾，真空過夜干燥，得到酒石酸沃尼妙林晶體。

1.4 理化性質分析 掃描電鏡(SEM)分析：使用荷蘭Eindhoven公司Phillips XL30 SEM-FEG掃描電鏡觀察酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林固體粉末，操作電壓15 kV。X-射線衍射分析：使用由布魯克公司的Bruker-D8 ADVANCE XD-3 X-射線衍射儀測定鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林的X- 射線衍射譜。在40 kV/30mA、CuK-α1X 射線(波長=1.5406 埃)條件，在2θ為5°～ 40°的范圍，使用0.2 秒鐘計數/0.018°步長以連續模式運行的測角計測定。

1.5 鹽酸沃尼妙林與酒石酸沃尼妙林的穩定性試驗

1.5.1 光照射試驗 取真空干燥至恒重的樣品適量，參照(2006-2011)《獸藥研究技術指導原則匯編》中獸用化學藥物穩定性研究技術指導原則，將含量為99.7%酒石酸沃尼妙林和99.0%鹽酸沃尼妙林平鋪于表面皿中，在照度為4500±500 LUX的條件放置，于0(對照)、5、10、25、60 d取樣，用高效液相色譜(HPLC)儀測試。

1.5.2 引濕性試驗 取適量樣品平鋪于稱量瓶中，在溫度30 ℃，濕度65%和78%的條件下分別放置24、48 h，取樣測試水分吸收量。

1.5.3 高效液相色譜(HPLC)分析 沃尼妙林的含量測定和雜質測定方法參考歐洲藥典《鹽酸沃尼妙林的測定》，配置UV檢測器的Waters 2695系統，十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑的Waters X-Bridge 柱(4.6 mm×150 mm，3 μm particle size)進行分離測定。

1.6 體外抑菌試驗菌株 參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林的抑菌效果，比較所選試驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)。質控菌株：肺炎鏈球菌ATCC 49619和其他分離菌株：胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌，豬鏈球菌、溶血巴氏菌、金黃色葡萄球菌，來源于中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡(SEM)分析 酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林的掃描電鏡結果列于圖2。可以看出兩種鹽有不同的形貌，酒石酸沃尼妙林呈現桿狀結晶形狀，而鹽酸沃尼妙林呈現出大塊、易碎的片狀固體結構。

2.2 X-射線衍射分析 酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林的X-衍射譜分析結果列于圖3。從圖3可以看出酒石酸沃尼妙林在5.563,6.361,8.741,10.560,11.223,11.891,12.775,13.486,15.048,16.384,17.689和17.689(2θ ± 0.2°)處呈現出特征峰，然而鹽酸沃尼妙林的X-衍射譜無特征峰出現，只有一個坡度變化寬展而緩和的吸收峰。

圖2 鹽酸沃尼妙林 (A)和酒石酸沃尼妙林(B)的掃描電鏡圖像Fig 2 Scanning electron micrographs (SEM) of valnemulin hydrochloride (A) and (B) valnemulin hydrogen tartrate crystal

圖3 鹽酸沃尼妙林(A)和酒石酸沃尼妙林(B)的粉末X-衍射光譜Fig 3 X-ray powder diffractometry (XRD) spectra of valnemulin hydrochloride (A) and valnemulin hydrogen tartrate crystal (B)

2.3 穩定性試驗 為了比較鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林理化性質的穩定性，進行了光照和引濕性試驗。圖4為鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林在0(對照)、5、10、25、60 d含量的變化，可以看出，光照60 d以后，酒石酸沃尼妙林的含量為96.2%，與99.7%的初始含量相比，降解了3.5%，然而鹽酸沃尼妙林含量的降低較明顯，由99.0%降至80.8%，即減少了18.2%。

圖4 光照條件下酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林中游離態沃尼妙林隨時間變化曲線Fig 4 Time courses of the free valnemulin levels of valnemulin hydrogen fumarate and valnemulin hydrochloride under irradiation condition.

圖5列出了鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林在相對濕度(RH)為65%和78%的條件下吸水量的變化。結果表明鹽酸沃尼妙林，在濕度65%的條件下吸水量為4.50%，而在濕度78%的條件下吸水量高達9.71%，酒石酸沃尼妙林在上述條件下的吸水量分別為1.30%、1.40%。

2.4 體外抑菌試驗 為確定酒石酸沃尼妙林抑菌效果，進行了體外抑菌試驗，并與鹽酸沃尼妙林的MIC值進行了比較。如表1所示：酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林對細菌的敏感濃度一致：對胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度均為4 μg/mL，對副豬嗜血桿菌的最小抑菌濃度均為1～4 μg/mL，對多殺巴氏菌的最小抑菌濃度均為16～32 μg/mL，對豬鏈球菌的最小抑菌濃度均為1 μg/mL，對溶血巴氏菌的最小抑菌濃度均為4 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.02 μg/mL，對質控菌株肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度均為16 μg/mL。

圖5 在30 ℃, 65%和78%濕度條件下酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林吸水量隨時間變化曲線Fig 5 Profiles of adsorption of water of valnemulin hydrogen tartrate and valnemulin hydrochloride samples at 30 ℃, in 60% and 78% RH.

3 討論與結論

3.1 外部形貌和內部結構形態分析 藥物成鹽是改善藥物分子理化性質、提高其成藥性的有效手段之一。在新藥研發早期階段，將候選化合物成鹽可改善候選化合物的理化性質，如溶解度、結晶度、吸濕性、熔點和固態穩定性，減少其不良反應等[13-15]。藥物鹽型的篩選對選擇具有適宜藥學性質的固態劑型有重要的指導作用。

由于藥物與不同的鹽類反應條件的差異：比如溶劑、溫度、壓力、晶種，會產生不同的晶體/無定型態，從而產生不同的物理化學特性和藥學效果[15]。本研究掃描電鏡(SEM)分析結果體現出鹽酸沃尼妙林和結晶型酒石酸沃尼妙林形貌上的顯著差異；X-射線衍射分析表明鹽酸沃尼妙林和結晶型酒石酸沃尼妙林有不同的XRD特征，鹽酸沃尼妙林包含了一個寬展形狀、無特征吸收的峰，說明鹽酸沃尼妙林是無定形態，而酒石酸沃尼妙林的X-射線衍射圖中可以看到一組尖銳的強峰，且表現出較高的結晶度。沃尼妙林2種不同鹽類的XRD的分析結果與藥物穩定性分析一致，表明酒石酸沃尼妙林優良的穩定性歸因于其晶體特性。

表1 酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林的體外抗菌活性(MIC, μg/mL)Tab 1 Antibacterial activity (MIC, μg/mL) of valnemulin hydrogen tartrate and valnemulin hydrochloride in vitro.

a最低抑菌濃度(MIC):抑制細菌生長繁殖的最低藥物濃度;bApp胸膜肺炎放線桿菌；c HPS副豬嗜血桿菌；d PM 多殺巴氏菌

3.2 穩定性試驗

3.2.1 光照對不同沃尼妙林鹽穩定性的影響 光試驗表明，經60 d的照射，鹽酸沃尼妙林含量降低比較明顯，由99.0%將降至80.8%，即減少了18.2%，酒石酸沃尼妙林的含量為96.2% ，略低于99.7%，相對于鹽酸沃尼妙林，酒石酸沃尼妙林大大降低了對光照的敏感性。為了從光降解的機理方面解釋酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林光照穩定性的差異，本研究采用圖6的液相色譜圖比較了鹽酸沃尼妙林和酒石酸沃尼妙林光照射試驗降解產物的差異。圖6 (A1)顯示照射60 d后鹽酸沃尼妙林產生了一些小的降解產物峰，通過與標準品的保留時間匹配，確定主要降解產物沃尼妙林亞砜，保留時間為6.2 min。與先前報道的富馬酸沃尼妙林的光降解產物——沃尼妙林亞砜研究結果相一致[16]。相反，如圖6(B1)所示，在整個60 d的光照試驗中，酒石酸沃尼妙林幾乎沒有檢測到明顯的降解產物。上述結果表明酒石酸沃尼妙林晶體，穩定性優于無定型的鹽酸沃尼妙林。

3.2.2 濕度對不同沃尼妙林鹽穩定性的影響 引濕性是影響化合物穩定性的主要因素之一。酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林在不同相對濕度(RH)的條件下引濕性結果表明酒石酸沃尼妙林的吸水量增加較小，在相對濕度65%和78%的條件下的吸水量分別為1.40%、1.30%，根據2010版《中國獸藥典》，判定為具有輕微引濕性(<2%)；鹽酸沃尼妙林在濕度78%的條件下吸水高達9.71%，在濕度65%的條件下吸水也有4.50%，超出中國獸藥典規定的輕微引濕性(<2%)的限量，判定為具有引濕性。引濕性試驗結果表明，酒石酸沃尼妙林對濕度變化不敏感，表現出優越的抗吸水性，而鹽酸沃尼妙林有極強的吸濕性。酒石酸沃尼妙林的貯存條件不苛刻，應用范圍更廣泛，在開發簡單和新穎的劑型方面具有潛在的應用價值。

3.3 MIC試驗 酒石酸沃尼妙林對革蘭陰性和革蘭陽性病原菌的體外抗菌活性試驗MIC 值與無定形鹽酸沃尼妙林一致，二者有相同的抑菌活性，可以推斷水溶液中，酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林均可迅速解離，游離態的沃尼妙林堿發揮藥效。酒石酸沃尼妙林與鹽酸沃尼妙林藥效的體外抑菌試驗等效性，以及酒石酸沃尼妙林對光照、濕度的穩定性和動物飼喂適口性表明晶態的酒石酸沃尼妙林，具備潛在的應用價值。

圖6 鹽酸沃尼妙林(A)和酒石酸沃尼妙林(B)光照前(0 day)后(90 day)的高效液相色譜圖Fig 6 HPLC spectra of valnemulin hydrochloride (A) and valnemulin hydrogen tartrate(B) after irradiation for 0 and 90 days.

本研究制備了一種結晶態的沃尼妙林有機酸鹽——酒石酸沃尼妙林，用XRD和SEM對其物理化學性質進行表征。XRD和SEM結果表明酒石酸沃尼妙林的形貌和內部結構完全不同于鹽酸沃尼妙林，前者具有高的結晶性,而后者是無定型模式。在光照條件下，酒石酸沃尼妙林具有比鹽酸沃尼妙林更強的穩定性。鹽酸沃尼妙林的光降解產物主要是沃尼妙林氧化亞砜。在65%和78% RH條件下鹽酸沃尼妙林樣品有吸濕性，而酒石酸沃尼妙林對濕度變化不敏感。抑菌敏感性測試試驗表明酒石酸沃尼妙林和鹽酸沃尼妙林鹽有相同的抑菌活性。因此,酒石酸沃尼妙林貯存穩定、易于制備制劑、給藥方便、減少人力物力、節約了養殖成本，具有應用潛力。