甜菜夜蛾細胞色素P450基因的克隆與分析

袁 遠，高 熹，張連根，倪 峰，高 儼，吳毅歆，喜 超，朱家位*

(1.云南農業大學，云南 昆明 650201；2.云南高原特色產業研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】細胞色素P450單加氧酶系統是主要的解毒酶系統之一，其參與昆蟲中對各種生物殺蟲劑體內反應及昆蟲自身化學組成的新陳代謝。細胞色素P450是一種促使電子從NADPH向P450氧化還原劑[1-2]。【前人研究進展】昆蟲細胞色素P450于1967年由Ray首先發現[3]。目前，已研究了20多種昆蟲的細胞色素P450。研究表明P450在昆蟲對殺蟲劑代謝過程中起關鍵作用，昆蟲產生殺蟲劑抗藥性的重要原因是由于一個或幾個P450基因過量表達導致P450解毒酶量的增加導致體內單加氧酶系介導的代謝反應，從而引起昆蟲對殺蟲劑產生抗性[4]。近年來，細胞色素P450新基因被不斷克隆其結構，其表達調控、抗性關系的研究取得了一定的進展[5]。P450酶系統在昆蟲體內多種內源物的代謝中起到至關重要的作用，同時參與昆蟲體內激素等物質的生物合成和降解[6-7]以及脫皮素平衡的多個步驟[8]。甜菜夜蛾Spodopteraexigua是中國危害嚴重的害蟲之一，多年來對于甜菜夜蛾的防治手段主要是依靠化學防治。但是，長期濫用化學農藥導致甜菜夜蛾對多種農藥產生了很強的抗藥性。研究該害蟲抗藥性機制，將有助于對該害蟲進行有效的防治。【本研究切入點】本研究以甜菜夜蛾為研究對象，采用RACE技術，克隆甜菜夜蛾細胞色素P450基因，并利用生物學軟件對其基因結構進行分析。【擬解決的關鍵問題】為探究甜菜夜蛾產生抗藥性的機理提供分子依據，同時為其他學者研究昆蟲P450基因提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲

甜菜夜蛾成蟲采自云南省昆明市斗南玫瑰種植基地，供作試驗用蛾。

1.2 總RNA的抽提

供試蟲體的總RNA提取采用王玉成等方法[9]。

1.3 RACE

以新鮮抽提的甜菜夜蛾總RNA為材料，利用CLONTECH公司的Smarttm RACE cDNA Amplification Kit，合成3′和5′ RACE cDNA模板。根據細胞色素P450保守結構域序列，設計基因特異性3′ RACE簡并引物(3′ RACE gene-specific primer，3′ GSP)，使用RACE試劑盒中的UPM引物，通過PCR獲得P450的3′端序列，依據獲得的3′端序列設計基因特異性5′引物擴增獲得5′端序列。具體方法及步驟采用朱家穎等方法[10]。

1.4 克隆及序列測定

1.4.1 連接反應 將PCR擴增產物回收液與Pmd19-T載體進行連接后，室溫撫育1 h，4 ℃過夜。反應體系：pMD19-T (50 ng/μl) 1 μl，Solution I 5 μl，PCR純化產物 4 μl，總體積10 μl。

1.4.2 感受態細胞的制備 采用CaCl2法[11]制備大腸桿菌感受態細胞。

1.4.3 轉化和篩選 取感受態細胞100 μl加入10 μl連接物，冰浴30 min。42 ℃水浴熱激90 s立刻置于冰上10 min，加入預冷LB培養液900 μl。37 ℃搖床低速培養1 h后3000 r/min離心30 s，吸去上清至剩余200 μl，將沉淀輕輕懸浮。取懸浮液100 μl涂布在含Amp(50～100 mg/mL)的LB平板(先涂布4 μl 200 mg/LIPTG和40 μl 20 mg/mLX-Gal)靜置30 min，待菌液被完全吸收后37 ℃倒置培養16 h。當出現明顯而又未重疊的單菌落時，拿出平板篩選白色單菌落置5 mL含Amp(50～100 mg/mL)的LB培養液中，37 ℃培養8～12 h，菌液渾濁，4 ℃保存。

“*”星號表示終止子The asterisk marked the translation-termination codon圖1 SexiP450基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences of SexiP450 and deduced amino acid sequences

1.4.4 送檢測序 含目的片段質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，涂平板后通過藍白斑篩選以及菌液PCR檢測陽性重組克隆，菌液送公司測序。

1.5 序列分析

核苷酸的翻譯和氨基酸比對使用Genetyx-min 5.1和ClustalX 1.83軟件分析[12]。蛋白信號肽預測使用SignalP在線分析工具[13]。

2 結果與分析

2.1 cDNA克隆及序列分析

將3′和5′ RACE擴增所得目的基因片段拼接后，得甜菜夜蛾色素細胞P450基因的全長序列為894 bp，開放閱讀框411 bp，3′和5′端非編碼序列分別為79和213 bp，命名為SexiP450(圖1)。該基因編碼194個氨基酸，推導的氨基酸序列編碼194個氨基酸。SignalP預測編碼蛋白質的分子量為22.30 kDa，等電點為8.22，該蛋白無信號肽序列(圖2)。

2.2 同源性比較和分析

SexiP450與其它昆蟲細胞色素P450基因的氨基酸序列ClustalX對比結果見圖3。從圖可見，其中與斜紋夜蛾Spodopteralitura、甘藍夜蛾Mamestrabrassicae、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera和谷實夜蛾Helicoverpazea細胞色素P450的相似性分別為42 %、41 %、39 %和42 %。

圖2 蛋白質信號肽分析Fig.2 Analysis of signal peptide protein

3 討 論

細胞色素P450基因在昆蟲抗藥性及對寄主植物適應性中的重要作用引起了廣大學者的重視。目前NCBI中己報道了多個昆蟲的P450基因序列，如赤擬谷盜[14]、家蠶[15]、黑腹果蠅[16]、意大利蜜蜂[17]、麗蠅蛹集金小蜂[18]、人虱[19]等。昆蟲細胞色素p450基因的研究從目標昆蟲中克隆獲得一個細胞色素P450基因的全長cDNA序列進行分析，目前已有大量有關細胞色素P450基因的研究報道[5,20]。本研究利用RACE技術，從甜菜夜蛾中克隆獲得一個細胞色素P450基因的全長cDNA序列，根據其cDNA序列推導的氨基酸序列表明，SexiP450特征：相對分子量為22.30 kDa，通過分析發現并無信號肽。近年隨著基因組學的不斷發展，許多細胞色素P450基因逐漸從昆蟲基因組中被發掘。據此，更多的甜菜夜蛾細胞色素P450基因有待克隆獲得。同源性比對分析發現，甜菜夜蛾細胞色素P450基因與其它昆蟲細胞色素P450基因在氨基酸水平上與同目昆蟲的相似性很高，而與其他目的昆蟲的相對比較低一些。細胞色素P450基因結構多樣、分布廣泛、功能復雜及基因調控性多樣，隨著基因組學的發展越來越受到學界的廣泛關注，其在昆蟲的生長發育、取食等過程中的作用正逐步被解開，本研究結果為科研人員深入探究昆蟲P450基因結構與功能提供了方法借鑒。隨著對P450研究的深入其與昆蟲產生抗藥性之間的分子機理必將會被人類揭示。

相同和相似的氨基酸分別用黑色和灰色標出。Sexi為斜紋夜蛾(AAP80766)，Mbra為甘藍夜蛾(AAR26518)，Harm為棉鈴蟲(AAV28704)，Hzea為谷實夜蛾(ABH09252)The identical and similar amino acids mark in dark and grey. Sexi is Spodoptera litura (AAP80766); Mbra is Mamestra brassicae (AAR26518); Harm is Helicoverpa armigera (AAV28704); Hzea is Helicoverpa zea (ABH09252)圖2 SexiP450與其它昆蟲P450基因的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment between SexiP450 and other insects’ cytochrome P450 gene

4 結 論

利用RACE技術，從甜菜夜蛾中克隆獲得1個細胞色素P450基因的全長cDNA序列，大小為894 bp，開放閱讀框411 bp，3′和5′端非編碼序列分別為79和213 bp，編碼194個氨基酸。利用SignalP，Genetyx-min 5.1和ClustalX生物信息學軟件對其基因結構進行分析預測顯示該蛋白無信號肽序列，其氨基酸序列比對與斜紋夜蛾、甘藍夜蛾、棉鈴蟲和谷實夜蛾細胞色素P450的相似性分別為42 %、41 %、39 %和42 %。通過對該基因的分析預測可為探究甜菜夜蛾產生抗藥性的機理提供參考，同時為其他學者研究昆蟲P450基因提供借鑒和參考。