N-乙酰半胱氨酸改善高脂高糖聯合缺氧/復氧致H9C2心肌細胞損傷的實驗研究

李源 夏中元

[摘要] 目的 探討抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）對高脂高糖聯合缺氧/復氧所致H9C2心肌細胞損傷及其對時鐘基因BMAL1表達的影響。 方法 將培養的H9C2細胞分為對照組（N組）、高脂高糖聯合缺氧/復氧組（HFHG+H/R組）、高脂高糖聯合缺氧/復氧+NAC組（HFHG+H/R+NAC組）。CCK-8法檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞凋亡，DCFH-DA染色觀察活性氧（ROS）水平，JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位（MMP），Western blot測定BMAL1表達水平。 結果 與N組比較，HFHG+H/R組細胞活性明顯降低（P < 0.01），凋亡率與ROS水平明顯升高（P < 0.01），而BMAL1表達水平顯著降低（P < 0.01）。經NAC處理后，HFHG+H/R+NAC組以上變化均顯著減小，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。HFHG+H/R組MMP較N組明顯降低;經NAC處理后，HFHG+H/R+NAC組MMP明顯升高。 結論 NAC可能通過抑制心肌細胞氧化應激水平，并促進時鐘基因BMAL1表達，從而減小高脂高糖與缺氧/復氧所導致的心肌細胞損傷。

[關鍵詞] N-乙酰半胱氨酸;BMAL1;氧化應激;心肌細胞

[中圖分類號] R587.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of antioxidant N-acetylcysteine （NAC） on H9C2 cardiomyocyte injury induced by high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation and its effect on the expression of clock gene BMAL1. Methods H9C2 cells were divided into control group （N group）， high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation group （HFHG+H/R group）， high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation +NAC group （HFHG+H/R+NAC group）. Cell viability was detected by CCK-8 method， cell apoptosis was detected by the flow cytometry， reactive oxygen species （ROS） level was observed by DCFH-DA staining， mitochondrial membrane potential （MMP） was detected by JC-1 staining， and the expression level of BMAL1 was determined by Western blot. Results Compared with N group， the cell viability of HFHG+H/R group was significantly lower （P < 0.01）， the apoptosis rate and ROS level were significantly increased （P < 0.01）， while the expression level of BMAL1 was significantly reduced （P < 0.01）. After NAC treatment， the changes of indicators above in the HFHG+H/R+NAC group were significantly reduced， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. MMP in the HFHG+H/R group was significantly lower than that in the N group. After NAC treatment， MMP of HFHG+H/R+NAC group was significantly increased. Conclusion NAC may reduce the oxidative stress level of cardiomyocytes and promote the expression level of clock gene BMAL1， thereby reducing cardiomyocyte damage induced by high-fat and high-glucose combined with hypoxia/reoxygenation.

[Key words] N-acetylcysteine; BMAL1; Oxidative stress; Cardiomyocyte

缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD）是2型糖尿病（T2DM）患者的主要死亡原因。改善缺血心肌的血液灌注是治療IHD最根本的措施，但缺血再灌注會導致缺血心肌損傷的進一步加重[1]。研究表明，氧化應激是糖尿病并發癥IHD缺血再灌注損傷的主要機制[2-3]。近年研究發現節律紊亂是增加糖尿病、肥胖和代謝綜合征風險的一個重要因素，并可能是導致心血管事件發生的重要機制[4]。進一步研究發現，胰島素分泌具有特殊節律，并與時鐘基因BMAL1密切相關[5]。不僅如此，BMAL1亦有調控氧化應激的作用[6]。因此，本研究旨在明確體外條件下抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）對高脂高糖復合缺氧/復氧所致H9C2細胞損傷的保護作用，并探索其對時鐘基因BMAL1表達的影響。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

H9C2大鼠胚胎心肌細胞購自武漢大學細胞典藏中心。活性氧（ROS）試劑盒（批號：170824）、JC-1試劑盒（批號：170904）、Cell Counting Kit-8（CCK-8）（批號：170716）均購自中國碧云天公司;PE/7-AAD試劑盒（批號：7026588）購自美國BD公司;BMAL1抗體購自美國Novus公司;β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司;羊抗兔二抗購自美國Li-cor公司;NAC試劑購自美國sigma公司;熒光顯微鏡來自奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 H9C2大鼠心肌細胞的培養? 使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養H9C2細胞。實驗前去血清培養24 h，使細胞同步化，然后對心肌細胞分別進行如下處理：對照組（N組）培養基中含5.5 mmol/L葡萄糖、20 mmol/L甘露醇，高脂高糖復合缺氧/復氧組（HFHG+H/R組）培養基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L軟脂酸，高脂高糖復合缺氧/復氧+NAC組（HFHG+H/R+NAC組）培養基中含25 mmol/L葡萄糖、500 μmol/L軟脂酸、400 μmol/L NAC。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性? 取對數生長期的H9C2細胞，計數后種植于96孔板，每孔種植細胞數為10 000個，每個處理組設3個復孔。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養24～72 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液于酶標儀檢測。置于酶標儀中在450 nm處檢測吸光度值（OD值），以“培養液空白對照孔”調零。細胞存活率（%）=處理組A/對照組A×100%。

1.2.3 JC-1法檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）? 處理各組細胞后，用PBS洗滌1次，加入DMEM 1 mL，再加入1 mL JC-1染色工作液并混勻。在37℃培養箱中孵育20 min。孵育同時，按1∶4比例混勻染色緩沖液（5×）和蒸餾水，配制成染色緩沖液（1×），置于冰上。孵育完成后，用配好的JC-1染色緩沖液（1×）將細胞洗2次。再加入2 mL DMEM后置于熒光顯微鏡下，觀察并記錄各組細胞的熒光強度。

1.2.4 Western blot檢測BMAL1表達水平? 收集處理各組細胞，經RIPA裂解，超聲破碎，12 000 g 4℃離心，取上清。用BCA法測定蛋白樣品濃度，用RIPA校正。按體積比4∶1加入5×上樣緩沖液，100℃金屬浴5～10 min。按50 μg/泳道行SDS-PAGE凝膠電泳，于100 V恒壓下電泳90 min，200 mA恒流轉膜90 min，5%脫脂牛奶封閉1 h，使用兔抗鼠抗體抗（1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，熒光二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次，最后，用Odyssey熒光紅外成像系統進行掃膜分析并讀取各組灰度值。

1.2.5 DCFH-DA染色檢測ROS水平? 去除培養板中培養液，更換含有DCFH-DA（終濃度為10 μmol/L）的DMEM培養基。37℃培養箱中孵育20 min。用無血清DMEM洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察各組細胞熒光強度。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡? 收集處理后各組細胞，計數1×107個細胞，離心去上清，PBS洗滌2次，離心去上清，加入100 μL結合緩沖液重懸，加入5 μL 7-AAD、5 μL PE溶液混勻，避光孵育20～30 min，再加入400 μL緩沖液混勻，流式細胞儀分析凋亡率。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。本研究數據均符合正態分布。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點三組細胞活力比較

在培養24、48、72 h時，三組細胞活力總體比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與N組比較，HFHG+H/R組細胞活性明顯下降（P < 0.01），加入NAC后細胞活力較HFHG+H/R組明顯提高（P < 0.01）。

2.2 三組細胞ROS水平比較

三組ROS水平比較，差異有統計學意義（F = 383.9，P < 0.01）;與N組（0.019±0.003）比較，HFHG+H/R組ROS（0.099±0.003）生成明顯增多（P < 0.01）;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組ROS（0.016±0.002）生成明顯減少（P < 0.01）。

2.3 三組細胞MMP比較

與N組比較，HFHG+H/R組MMP明顯降低;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組MMP明顯升高。

2.4 三組細胞凋亡率比較

三組細胞凋亡率比較，差異有高度統計學意義（F = 1746.0，P < 0.01）。與N組[（0.912±0.015）%]比較，HFHG+H/R組細胞凋亡率[（16.601±0.304）%]明顯升高（P < 0.01）;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組細胞凋亡率[（8.055±0.115）%]明顯降低（P < 0.01）。

2.5 三組細胞BMAL1蛋白表達水平比較

三組BMAL1蛋白表達水平比較，差異有高度統計學意義（F = 1867.0，P < 0.01）。與N組比較，HFHG+H/R組BMAL1表達明顯降低（P < 0.01）;與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組BMAL1表達明顯升高（P < 0.01）。

3 討論

T2DM可通過持續性高血糖癥、高脂血癥、增加的ROS產生和炎癥通路下游轉錄因子，影響心肌糖/脂代謝、肌細胞生長、內皮功能和心肌結構的改變等誘導糖尿病心肌病[7]。而心肌組織中過度產生的ROS被認為是糖尿病心肌病發展的最主要機制之一[8]。心肌在高糖高脂的外環境下，氧化應激與脂質過載增加，可能是ROS產生的主要原因[9]。心肌細胞中ROS主要來源于NADPH和線粒體[10]。NAC可直接透過細胞膜及線粒體膜而直接清除ROS。

T2DM主要發病機制是胰島素抵抗，血脂代謝異常可加重胰島素抵抗[11]。長期高脂高糖刺激亦可對心肌細胞產生損傷[12]。研究表示高脂高糖可造成乳鼠心肌細胞損傷[13]。本研究選擇H9C2心肌細胞進行實驗，對各組細胞分別培養24、48、72 h后進行處理，再使用CCK-8實驗檢測細胞活力。各時間點細胞中，HFHG+H/R組細胞活性與N組比較均出現明顯下降（P < 0.01），加入NAC后細胞活力均有明顯提高（P < 0.01），提示NAC可改善高脂高糖與缺氧/復氧加重的H9C2心肌細胞損傷。因為培養24 h各組即可出現明顯差異，且差異有統計學意義，因此，培養時間我們選擇24 h。

隨后，我們通過熒光顯微鏡觀察細胞的ROS水平，與HFHG+H/R組比較，加入NAC后細胞ROS表達明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01），提示NAC可減輕高脂高糖復合缺氧/復氧導致的ROS上升。

細胞損傷的最終表現就是細胞死亡，細胞死亡主要方式為壞死和凋亡[14]。MMP水平下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件[15]。JC-1熒光探針可檢測MMP水平。熒光顯微鏡觀察顯示，與N組比較，HFHG+H/R組紅色熒光明顯降低，加入NAC后，HFHG+H/R+NAC組紅色熒光明顯升高;流式細胞儀凋亡檢測結果與JC-1結果一致。提示高脂高糖復合缺氧/復氧可使H9C2心肌細胞凋亡加重，而NAC可減輕這一促進作用。

研究表明核心時鐘基因BMAL1靶向缺失的小鼠（BMAL1-/-）顯示了不同器官的高水平的ROS[16]，還有研究表明，BMAL1缺失的小鼠ROS產生增加[17]，表明BMAL1在氧化還原穩態中產生了作用。

晝夜節律紊亂可影響糖脂代謝，亦可促進T2DM的發展[18-19]。BMAL1的表達與胰島生長、存活和增殖調節有關，通過藥物影響細胞中BMAL1的表達可改善胰島損傷[20]。本研究中，與HFHG+H/R組比較，HFHG+H/R+NAC組BMAL1的表達明顯升高（P < 0.01），提示NAC可影響高脂高糖復合缺氧/復氧處理的H9C2心肌細胞BMAL1的表達水平。

綜上所述，NAC可能通過抑制心肌細胞氧化應激水平，并促進時鐘基因BMAL1表達水平，從而減小高脂高糖復合缺氧/復氧所導致的心肌細胞損傷。

本研究主要在細胞上進行了實驗和論證，在動物模型上尚未驗證，具有一定局限性，后期將進一步對糖尿病大鼠進行實驗研究。本研究通過使用缺氧/復氧模擬缺血再灌注并用ROS抑制劑NAC作用于高脂高糖培養的H9C2心肌細胞，通過對BMAL1表達、細胞活性、MMP、凋亡率和ROS水平的檢測，得出結論：NAC可能通過抑制心肌細胞氧化應激水平，并促進時鐘基因BMAL1表達水平，從而減小高脂高糖復合缺氧/復氧所導致的心肌細胞損傷。

[參考文獻]

[1]? 國科，劉達興，容松.心肌缺血再灌注損傷的發生機制及其防治策略[J].中國醫藥導報，2016，13（29）：37-40.

[2]? Bhattacharya S，Manna P，Gachhui R，et al. D-saccharic acid 1，4-lactone protects diabetic rat kidney by ameliorating hyperglycemia-mediated oxidative stress and renal inflammatory cytokines via NF-κB and PKC signaling [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2013，267（1）：16-29.

[3]? Cheng YC，Sheen JM，Hu WL，et al. Polyphenols and Oxidative Stress in Atherosclerosis-Related Ischemic Heart Disease and Stroke [J]. Oxid Med Cell Longev，2017，2017（5）：1-16.

[4]? Peliciari-Garcia RA，Goel M，Aristorenas JA，et al. Altered myocardial metabolic adaptation to increased fatty acid availability in cardiomyocyte-specific CLOCK mutant mice [J]. Biochim Biophys Acta，2016，1861（10）：1579-1595.

[5]? Rakshit K，Thomas AP，Matveyenko AV. Does disruption of circadian rhythms contribute to beta-cell failure in type 2 diabetes？[J]. Curr Diab Rep，2014，14（4）：474.

[6]? Lee J，Moulik M，Fang Z，et al. Bmal1 and β-cell clock are required for adaptation to circadian disruption，and their loss of function leads to oxidative stress-induced β-cell failure in mice [J]. Mol Cell Biol，2013，33（11）：2327-2338.

[7]? Lee TI，Bai KJ，Chen YC，et al. Histone deacetylase inhibition of cardiac autophagy in rats on a high-fat diet with low-dose streptozotocin-induced type 2 diabetes mellitus [J]. Mol Med Rep，2017，17（1）：594-601

[8]? Casellini CM，Parson HK，Hodges K，et al. Bariatric Surgery Restores Cardiac and Sudomotor Autonomic C-Fiber Dysfunction towards Normal in Obese Subjects with Type 2 Diabetes [J]. PLoS One，2016，11（5）：e0154211.

[9]? Boudina S，Abel ED. Diabetic cardiomyopathy，causes and effects [J]. Rev Endocr Metab Disord，2010，11（1）：31-39.

[10]? Nabeebaccus A，Zhang M，Shah AM. NADPH oxidases and cardiac remodelling [J]. Heart Fail Rev，2011，16（1）：5-12.

[11]? 崔雅忠，楊丹，張倩，等.STZ誘導的2型與1型糖尿病大鼠模型的對比研究[J].醫學研究雜志，2018，47（5）：36-38.

[12]? Chowdhry MF，Vohra HA，Gali？觡anes M. Diabetes increases apoptosis and necrosis in both ischemic and nonischemic human myocardium：role of caspases and poly-adenosine diphosphate-ribose polymerase [J]. J Thorac Cardiovasc Surg，2007，134（1）：124-131.

[13]? Ricci C，Jong CJ，Schaffer SW. Proapoptotic and antiapoptotic effects of hyperglycemia：role of insulin signaling [J]. Can J Physiol Pharmacol，2008，86（4）：166-172.

[14]? Buja LM，Entman ML. Modes of Myocardial Cell Injury and Cell Death in Ischemic Heart Disease [J]. Circulation，1998，98（14）：1355-1357.

[15]? Tungjai M，Phathakanon N，Rithidech KN. Effects of Medical Diagnostic Low-dose X Rays on Human Lymphocytes：Mitochondrial Membrane Potential，Apoptosis and Cell Cycle [J]. Health Phys，2017，112（5）：458-464.

[16]? Kondratova AA，Dubrovsky YV，Antoch MP，et al. Circadian clock proteins control adaptation to novel environment and，memory formation [J]. Aging（Albany NY），2010， 2（5）：285-297.

[17]? Hemmeryckx B，Hohensinner P，Swinnen M，et al. Anti-oxidant treatment improves cardiac dysfunction in a murine model of premature ageing [J]. J Cardiovasc Pharmacol，2016，15（32）：6720-6724.

[18]? Koektuerk B，Aksoy M，Horlitz M，et al. Role of diabetes in heart rhythm disorders [J]. World J Diabetes，2016，7（3）：45-49.

[19]? Wu T，Yang L，Jiang J，et al. Chronic glucocorticoid treatment induced circadian clock disorder leads to lipid metabolism and gut microbiota alterations in rats [J]. Life Sci，2018，192：173-182.

[20]? Zhao R，Xu G，Zhang T，et al. Effects of Lycium barbarum. polysaccharide on type 2 diabetes mellitus rats by regulating biological rhythms [J]. Iran J Basic Med Sci，2016，19（9）：1024-1030.

（收稿日期：2018-08-14? 本文編輯：羅喬荔）