NLRP3、IL-1βmRNA表達水平與酒精性肝硬化發(fā)病相關性及作用機制分析

董德嘉 盧海波 吳偉 豆發(fā)福

流行病學研究證實，我國2010至2017年酒精性肝硬化(ALC)的平均發(fā)病率可達373～492萬人左右[1-2]。探討血清學指標能夠在消化系統(tǒng)炎癥性疾病的病情評估過程中發(fā)揮重要作用。炎性小體(NLRP3)的上升能夠通過激活體內下游多種炎癥信號通路促進、加劇炎性細胞對肝臟上皮組織的浸潤，進而促進肝上皮細胞的凋亡和壞死[3]；白細胞介素(interleukin，IL-1β)的上升能夠通過加劇體內急性炎性反應，進而影響到機體免疫損傷過程。本研究選取我院收治的酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)患者、ALC患者，探討了相關指標的變化，現(xiàn)報道如下。

資料和方法

一、一般資料

選取我院2016年7月至2018年5月收治的AH患者74例、ALC患者30例，以及30 例由肝移植手術時獲得的正常肝組織樣本作為對照，所有樣本均為男性，均留有血漿樣本，進行相關生化指標的檢測。AH組患者年齡為(42.68±5.31)歲，飲酒時間(17.00±3.25)年，日均飲酒量(150.00±30.25)g；ALC組患者年齡為(42.97±6.82)歲，飲酒時間(21.05±6.82)年，日均飲酒量(80.20±15.32)g。

二、納入標準

參照中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組2010年修訂的《酒精性肝病診療指南》診斷入組；簽署試驗知情同意書。

三、排除標準

排除HBV、HCV和HIV感染、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病、肝臟原發(fā)性或繼發(fā)性惡性腫瘤、孕婦以及合并嚴重的心、腦、血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病者。

四、檢測方法

采集入院后靜脈血，離心后收集上清液，采用免疫發(fā)光法檢測NLRP3水平，檢測儀器為美國Bio-Bad全自動酶標儀，配套試劑盒購自羅氏檢測公司；收集上清液后加入采用全自動生化法檢測ALT、ALP、Alb、AST值，加入ALT、ALP、Alb、AST檢測試劑盒，配套試劑盒購自南京碧云天生物檢測公司，微型離心機HITETIC購自上海精密儀器有限公司。

采集患者的靜脈血5 mL，加入0.2 mL的氯仿， 2～8 ℃ 冰凍離心機中離心 (12 000 g/min，15 min)，反復1次洗滌RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入 1 mL 75% 乙醇， 0.1% DEPC 水溶解。加入IL-1βmRNA基因和 GAPDH 上下游引物、 0.1% DEPC 使其終濃度均為 20 pmol/μL，制備反應體系，RT-PCR 擴增條件與參數(shù)：48 ℃ 45 min，94 ℃ 2 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃ 60 s，68 ℃ 2 min 共 40 個循環(huán)；循環(huán)完畢后 68 ℃ 延伸 7 min。

五、統(tǒng)計學方法

結 果

一、樣本生化檢測資料

對不同組患者的各項生化指標進行檢測，結果見表1。

二、 不同組樣本間NLRP3表達量的對比

對照組樣本NLRP3表達量為(5.62±1.68) ng/mL，AH組樣本NLRP3表達量為(26.58±2.69) ng/mL，ALC組樣本NLRP3表達量為(31.35±5.58) ng/mL；對照組樣本的NLRP3的表達量與AH組(t=2.0086，P=0.0000)，ALC組(t=2.0484，P=0.0000)均差異有顯著統(tǒng)計學意義，AH組和ALC組的NLRP3表達量也差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=2.0086，P=0.0001)。對所有樣本進行NLRP3表達量檢測，結果見表2。

三、不同組樣本間IL-1βmRNA表達量的對比

對照組樣本IL-1βmRNA表達量為(0.15±0.02) ng/mL，AH組樣本IL-1βmRNA表達量為(0.41±0.12) ng/mL，ALC組樣本IL-1βmRNA表達量為(0.28±0.15) ng/mL；對照組樣本IL-1βmRNA表達量與AH組(t=2.0085，P=0.0000)，ALC組(t=2.4258，P=0.0025)均差異有顯著統(tǒng)計學意義，AH組和ALC組的IL-1βmRNA表達量也差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=2.0086，P=0.0018)。對所有樣本進行NLRP3表達量檢測，結果見表2。

四、 NLRP3、IL-1βmRNA表達量升高與部分肝功能改變的關系

對各樣本的NLRP3、IL-1βmRNA的升高量和肝功能指標進行對比，AH組和ALC組樣本血清中NLRP3和IL-1βmRNA的表達量均顯著高于對照組樣本，AH組的Alb指標稍有上升，ALC組的Alb水平顯著上升；AH與ALC組的ALT與ALP水平增幅基本一致；AH組和ALC組的AST增幅均超過50%，且AH組的指標高于ALC組，結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同組患者的各項生化指標

注：*中性粒細胞/淋巴細胞比值

表2 NLRP3、IL-1βmRNA表達量升高與部分肝功能改變的關系

注：AH組與ALC組比較，*P<0.05,^P>0.05

討 論

在乙型肝炎病毒感染病程較長的患者中，ALC或者AH的發(fā)生風險更高，遠期多器官功能衰竭或者病死率可進一步上升[4-6]。 NLRP3作為炎性小體，其能夠影響到體內的炎癥信號通路的激活，導致下游IL-6或者IL-8等炎性因子的激活，促進肝臟間質細胞纖維化改變。NLRP3上升還能夠促進中性粒細胞和巨噬細胞的富集，加劇了炎性細胞對于肝臟上皮細胞的吞噬和促凋亡作用[7-8]。NLRP3上升能夠導致肝臟上皮細胞線粒體的損傷和線粒體膜完整性的破壞，加速肝功能的惡化[9]；IL-1βmRNA能夠促進肝臟的炎性損傷，同時還能夠調控樹突狀T淋巴細胞的功能，影響到CD4+淋巴細胞的功能活性。

在ALC或者AH組患者血清中，NLRP3、IL-1βmRNA的表達濃度均明顯上升，提示NLRP3、IL-1βmRNA的高表達均可能影響ALC或者AH的病情進展。汪玉蘭等[10]也通過探討82例ALC患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)在病例組患者血清中，NLRP3的表達濃度可平均上升35%以上。NLRP3在正常對照人群、AH及ALC患者中的表達濃度逐漸上升，趨勢較為明顯，提示NLRP3在不同階段的肝臟病變過程中均具有持續(xù)性的促進作用。這主要是由于NLRP3上升能夠誘導淀粉樣蛋白β的激活，促進凋亡小體caspase-3的釋放[1]。IL-1βmRNA雖然在ALC或者AH患者中均具有明顯的上升表現(xiàn)，但相比于AH患者，IL-1βmRNA在ALC患者中的表達呈現(xiàn)下降的趨勢。這考慮與IL-1βmRNA作為急性炎性因子，在AH這一合并有明顯炎性肝臟損傷表現(xiàn)的患者中可以明顯上升，而ALC患者其肝臟纖維化過程中，炎性反應程度有所下降，IL-1βmRNA可逐漸下降。在AH和ALC患者中，均存在明顯的肝功能指標上升，同時NLRP3和IL-1βmRNA的表達量升高百分比均明顯上升，進一步提示NLRP3、IL-1βmRNA與AH或者ALC的病情關系。