穩(wěn)定同位素稀釋-UPLC-MS/MS法測(cè)定飼料中4種黃曲霉毒素

■孟繁磊 宋志峰 譚 莉 魏春雁

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，吉林長(zhǎng)春 130033）

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一組真菌毒素代謝物，主要有4種天然存在的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2。黃曲霉毒素對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物都是有毒和致癌的，黃曲霉毒素B1和G1比黃曲霉毒素B2和G2毒性更大[1-2]。由于這種毒性，政府規(guī)定嚴(yán)格限制其在食物中的含量，因此，就需要靈敏、精確、可重復(fù)的方法來(lái)檢測(cè)這些毒素。這些方法主要有基于配有熒光檢測(cè)器的反相高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。然而，因?yàn)榉聪嘞疵撘簳?huì)淬滅黃曲霉毒素B1和G1的熒光效應(yīng)，通常需要衍生以增強(qiáng)這些分析物的反應(yīng)，主要有三氟乙酸進(jìn)行柱前衍生[3]以及使用碘法[4]、電化學(xué)衍生溴法[5]、光化學(xué)UV衍生法進(jìn)行柱后衍生[6-7]等，但這些方法存在前處理過(guò)程繁瑣或需要配備單獨(dú)的衍生系統(tǒng)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展提高了選擇性和靈敏度，并提供了區(qū)分目標(biāo)物與共提取物的能力，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜也廣泛應(yīng)用于黃曲霉毒素的檢測(cè)[8-10]。但飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，常常存在較大的基質(zhì)效應(yīng)干擾，通過(guò)基質(zhì)配標(biāo)的方法可以校正，但一些基質(zhì)特別復(fù)雜的樣品基質(zhì)效應(yīng)很難校正。將穩(wěn)定同位素稀釋方法配合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)可以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，同時(shí)還可以消除前處理過(guò)程中的損失，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。因此，本文建立了飼料中4種黃曲霉毒素的穩(wěn)定同位素稀釋-超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法，優(yōu)化了前處理?xiàng)l件和儀器工作條件，以使方法能夠滿足飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

乙腈和甲醇（色譜級(jí)），賽默飛世爾科技公司；黃曲霉毒素B1（5 μg/ml）、黃曲霉毒素B2（5 μg/ml）、黃曲霉毒素 G1（5 μg/ml）、黃曲霉毒素 G2（5 μg/ml）、13C17-AFTB1（0.5 μg/ml）、13C17-AFTB2（0.5 μg/ml）、13C17-AFTG1（0.5 μg/ml）、13C17-AFTG2（0.5 μg/ml），均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超純水用Millipore純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 5500三重四級(jí)桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀（AB Sciex公司）；LC-30AD超高效液相色譜儀（島津公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；X3R離心機(jī)（Thermo公司）；VG3 S025渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）；MyCOsepTM226多功能凈化柱[ROMER國(guó)際貿(mào)易(北京)有限公司]。

1.3 準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml）

分別取質(zhì)量濃度均為5 μg/ml的黃曲霉毒素B1（AFTB1）、黃曲霉毒素B2（AFTB2）、黃曲霉毒素G1（AFTG1）、黃曲霉毒素G2（AFTG2）各200 μl于10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-20℃下密封避光保存。

1.3.2 混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(50 ng/ml)

準(zhǔn)確移取 0.5 μg/ml13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2各1 ml于10 ml容量瓶，用乙腈定容至刻度，-20℃下密封避光保存。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液

用50%的甲醇水溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/ml)配成 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2質(zhì)量濃度均為0.2、1、5、10、50、250 μg/l的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，使用時(shí)分別取此混合標(biāo)準(zhǔn)溶液450 μl與50 μl的混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液(50 ng/ml)混勻即得標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g飼料樣品（精確到0.01 g）于50 ml離心管中，加入250 μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液混合后靜置30 min，加入20 ml乙腈-水（84∶16，v/v），漩渦混勻，超聲波提取30 min，5 000 r/min離心10 min，收集上清液經(jīng)MyCOsepTM226多功能凈化柱凈化，取4 ml凈化液于50℃下氮?dú)獯蹈桑? ml初始流動(dòng)相溶解殘留物，漩渦混勻，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中，UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.5 UPLC-MS/MS儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動(dòng)相：A相為5 mmol/l甲酸銨溶液，B相為甲醇；梯度洗脫程序如下：0～1 min，36%B；3～4 min，50%B；4.2～5.5 min，100%B；5.6～8 min，36%B；流速：0.3 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：3 μl。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；電離模式：正模式；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；離子化電壓：5 500 V；氣簾氣30 psi；霧化溫度：550 ℃；霧化氣：55 psi；輔助氣：55 psi。其它質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4種黃曲霉毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

黃曲霉毒素常用的提取溶液為乙腈-水（84∶16，v/v）[11-12]和甲醇-水（70∶30，v/v）[13-14],本文以10 μg/kg的添加水平來(lái)考察兩種提取溶劑的提取效果，以4種黃曲霉毒素的回收率為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，用乙腈-水（84∶16，v/v）提取的回收率的略高，此外，乙腈-水（84∶16，v/v）為提取劑，對(duì)飼料中蛋白質(zhì)沉淀效果也較為明顯，所以，本文選擇乙腈-水（84∶16，v/v）為提取溶劑。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

將4種黃曲霉毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)用50%的甲醇配成50 μg/l的單標(biāo)，通過(guò)針泵直接進(jìn)樣，測(cè)定其在ESI+和ESI-的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種黃曲霉毒素及其同位素內(nèi)標(biāo)在ESI+模式下，可以得到豐度值較高的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，確定[M+H]+為其母離子；然后優(yōu)化去簇電壓DP，保證母離子的傳輸；接著采用子離子掃描，選擇2個(gè)響應(yīng)值較強(qiáng)的子離子（同位素內(nèi)標(biāo)只選擇1個(gè)響應(yīng)最強(qiáng)的子離子用于定量），最后對(duì)碰撞能量CE進(jìn)行優(yōu)化。質(zhì)譜條件的選擇結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 提取溶劑的選擇

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

將1.3.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按照1.5的條件依次進(jìn)樣檢測(cè)，以各黃曲霉毒素的濃度為橫坐標(biāo)x（μg/l），以各毒素峰面積與對(duì)應(yīng)毒素內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r2），線性范圍見(jiàn)表2。結(jié)果表明，4種黃曲霉毒素在0.18～225 μg/l范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。

2.3.2 方法的檢出限和定量限

用空白飼料樣品為基質(zhì)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度的添加量加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后按照1.4處理后測(cè)定，以信噪比（S/N）為3，確定方法的檢出限，以信噪比（S/N）為10，確定方法的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在本方法的檢測(cè)條件下，AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的檢出限分別為 0.015、0.025、0.015、0.025 μg/kg，定量限分別0.05、0.1、0.05、0.1 μg/kg，滿足檢測(cè)的要求。

2.3.3 加標(biāo)回收率和重復(fù)性

向空白的飼料樣品中加入黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以回收率試驗(yàn)來(lái)考察本方法正確度，同時(shí)以回收率測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的重復(fù)性。分別添加定量限、10倍定量限、限量值附近三個(gè)水平濃度，每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6次，具體的添加濃度、回收率和RSD結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，4種黃曲霉毒素的平均回收率在76.19%～102.29%之間，符合《GB 27417—2017合格評(píng)定化學(xué)分析方法確定和驗(yàn)證指南》的要求，表明該方法用于提取測(cè)定飼料中4種黃曲霉毒素準(zhǔn)確可行；4種黃曲霉毒素平均回收率的RSD在1.91%～10.12%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 4種黃曲毒素的回歸方程、線性范圍、檢出限、定量限

表3 4種黃曲霉毒素的添加回收率（n=6）

3 結(jié)論

本文建立了穩(wěn)定同位素稀釋-UPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定飼料中4種黃曲霉毒素的方法。樣品經(jīng)乙腈-水（84∶16，v/v）溶液超聲波提取后，采用MyCOsepTM226多功能凈化柱凈化后，用UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。提取前加入穩(wěn)定同位素一方面消除了基質(zhì)效應(yīng)的影響，另一方面對(duì)前處理過(guò)程中的損失也給予了校正。本方法具有前處理操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求，適用于飼料中4種黃曲霉毒素的定量分析，也可為其他基質(zhì)中4種黃曲霉毒素含量的檢測(cè)提供參考依據(jù)。