工廠化和網箱養殖大黃魚幼魚消化道微生物群結構與功能分析

■姜 燕 徐永江柳學周* 鄭煒強 陳 佳 史 寶王 濱

(1.農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；2.大黃魚育種國家重點實驗室寧德市富發水產有限公司，福建寧德 352103)

大黃魚（Larimichthys crocea）為我國傳統經濟魚類，也是我國主要的海水經濟魚種之一，其養殖業主要集中于我國浙江、福建等地。據統計，2017年大黃魚苗種產量為391 472萬尾，其養殖的年產量高達177 640噸，穩居海水養殖魚類榜首[1]，并被列為我國八大優勢出口養殖水產品之一。并且，與2016年相比，其產量明顯提高11.35%。伴隨養殖規模的不斷擴大，養殖過程中的各種問題也逐漸顯現，最終導致魚體處于不完全健康狀態，表現出對細菌性、寄生蟲性及病毒性等疾病病原的抵抗力逐漸下降[2-5]。

為解決上述問題，大黃魚產業正在從養殖設施、優質苗種生產、配合飼料使用、病害防控等方面推動養殖模式的轉型升級。而關于病害的預防與治療方面的研究也在不斷的開展與深入，其中包括各種有效藥物的研發、疫苗的研制及消化道微生物群調控的研究等[6-10]。消化道微生物群調控是近幾年提出的熱點課題，主要是通過微生物間的相互作用來實現，在生物、環保的基礎上有效提高魚體對環境變化的適應能力。

圍繞消化道微生物群開展生物調控，首先要清楚消化道微生物的結構特征，同時還要掌握魚體消化道微生物群與其生存環境中菌群的相互關系。本研究針對工廠化和網箱養殖大黃魚幼魚消化道菌群的組成與分布信息開展研究，明確消化道中的優勢物種，為大黃魚幼魚內源性益生菌的篩選奠定理論基礎。并且，查明大黃魚幼魚消化道菌群與環境菌群的相關性，為消化道菌群結構的調控途徑提供理論參考。同時，借助于16S rDNA高通量測序方法對大黃魚幼魚消化道微生物群基因參與的主要功能進行分析，為大黃魚幼魚消化道功能菌群的篩選提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚來源

實驗所用大黃魚幼魚由福建省富發水產有限公司提供，實驗中室內工廠化和海上網箱養殖的所有大黃魚苗種均來自于同一批受精卵孵化的健康幼魚。其中，工廠化養殖幼魚體重（0.36±0.133）g，體長（3.66±0.394）cm，養殖密度為1.7萬尾/m3；海上網箱養殖幼魚體重（0.54±0.055）g，體長（4.32±0.22）cm，養殖密度為750尾/m3。

1.2 樣品采集與處理

大黃魚幼魚樣本：隨機挑選一個工廠化養殖池和一個海上網箱分別作為兩個處理組，對每一個處理組的幼魚進行取樣，每組隨機采集20尾。將挑選的幼魚在滅菌海水中暫養20 min，連續進行3次，之后采用MS-222（Fluka,USA）進行麻醉處理，麻醉后立即進行解剖。解剖過程：75%酒精擦拭體表后采用消毒的解剖工具解剖取其完整消化道，去除內容物，之后用預冷的滅菌生理鹽水沖洗并分裝，于液氮中保存。整個解剖過程在無菌環境下進行。室內工廠化養殖大黃魚幼魚消化道樣本采用I0YG表示，I0YG1、I0YG2、I0YG3表示三個平行樣本；海上網箱養殖大黃魚幼魚消化道樣本采用C0YG表示，同樣，C0YG1、C0YG2、C0YG3表示三個平行樣本。

養殖用水樣本：對工廠化養殖幼魚進行進水口水樣的采集，共采集3次，每次3 L水；網箱養殖幼魚則對網箱中的水進行水樣采集，同樣采集3次，每次3 L水。水樣在現場經0.22 μm孔徑濾膜過濾后，保留濾膜至液氮中備用。其中，工廠化養殖用水樣本采用IYW表示，IYW1、IYW2、IYW3代表三個平行樣本；同樣，CYW1、CYW2、CYW3代表的是海上網箱的水樣本。

餌料樣本：不同模式養殖幼魚處于同一生長階段，因此投喂的配合飼料完全相同。準確稱取0.1 g配合飼料三份，分裝于無菌離心管中，液氮保存備用。采用s0YF代表餌料樣本，s0YF1、s0YF2、s0YF3則代表的是三個平行樣本。

1.3 微生物總DNA的提取與高通量測序

將液氮中保存的幼魚消化道樣本從液氮中取出，冰上自然解凍，每個處理組隨機選取三個樣本作為平行組，嚴格按照QIAamp DNA mini kit（QIAGEN,Ger?many）試劑盒說明書進行操作，提取消化道微生物總DNA。將收集的各水樣濾膜無菌粉碎后采用OME?GA Soil DNA kit（Omega Bio-Tek,USA）進行細菌總DNA的提取。將每個餌料樣本按照QIAamp DNA mini kit（QIAGEN,Germany）的說明提取細菌總DNA。之后，采用PCR技術擴增16S rDNAV3-V4高變區序列，擴增基因的正向引物338F：5'-ACTCCTAC?GGGAGGCAGCA-3'，反向引物806R：5'-GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3'。擴增的序列經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后交由商業測序公司通過Illumina MiSeq PE300平臺進行高通量測序。

1.4 數據處理與分析

測序所得的下機數據，采用Trimmomatic（v 0.35）[11]剪切、Flash（v 1.2.11）[12]拼接、Uchime（v 4.2）[13]去嵌合體等一系列處理得到有效序列（effective reads）。然后，采用Vsearch（v 2.4.2）[14]對所有樣品的全部有效序列進行歸類操作，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為一個OTU（Operational Taxonomic Units），并選取OTU的代表性序列。用RDP Classifer（v 2.2）[15]與Silva數據庫（v 123）對OTUs代表序列進行物種注釋。將測序所得有效tags數目最小值作為標準對其余樣本的有效tags進行均一化處理，Alpha和Beta多樣性均基于均一化后的數據進行解析。采用tax4fun（0.3.1）對微生物群基因參與的KEGG通路進行比對分析。

采取單因素方差分析（ANOVA）方法進行差異性分析，顯著性水平為P＜0.05。采用Kruskal Wallis檢驗對不同養殖模式幼魚消化道微生物群差異物種進行分析。所有數值均采用“平均值±標準誤”（Means±S.D.）表示。

2 結果

所有樣本經高通量測序及對測序結果數據的一系列處理后共獲得511 291條有效序列和2 230個有效OTU。其中，對所有樣本有效tags進行均一化處理的標準為27 487條。

2.1 α-多樣性

所有樣品的物種數目如圖1所示，室內工廠化養殖大黃魚幼魚消化道菌群的物種數目平均值為356，低于網箱養殖幼魚的467.7，但差異不顯著（P＞0.05）。餌料中的微生物物種數目顯著高于工廠化養殖幼魚消化道微生物物種數目（P＜0.05）。兩種模式下的幼魚消化道微生物的物種數目分別與水環境微生物的物種數目差異不顯著（P＞0.05）。

工廠化和網箱養殖大黃魚消化道微生物群的香濃指數分別為6.69和6.67，與餌料微生物群之間的差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于兩種水環境的（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 不同養殖模式下大黃魚幼魚消化道及環境微生物群α-多樣性（n=3）

2.2 大黃魚消化道微生物群結構特征

圖2顯示的是每一個樣本相對豐度排列前十的菌群。由圖2可以看出，在門水平，兩種環境下大黃魚幼魚消化道微生物組成比較相似，主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，其豐度之和為83.43%～92.84%。

圖2 不同養殖模式下大黃魚幼魚消化道優勢菌門

在屬水平，每一個消化道樣本中相對豐度高于1%的微生物物種如圖3所示。從圖3中可以看出，每一個樣本中豐度高于1%的菌屬的豐度和均低于60%，且物種數目為11或12，相對比較穩定。工廠化和網箱養殖大黃魚消化道優勢菌屬主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、醋菌屬（Acetobacte）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等19個物種。但是，網箱養殖中，發光桿菌屬（Photobacterium）和弧菌屬（Vibrio）在其中一個消化道樣本中豐度高達33.36%、9.16%，與其余兩個樣本的差異比較明顯。

以平行樣本共有菌屬為基礎，工廠化養殖大黃魚幼魚消化道菌屬水平的物種數目為84，網箱養殖大黃魚幼魚消化道中則為95個（圖4）。其中，網箱養殖大黃魚幼魚消化道特有菌屬遠高于工廠化養殖的，而兩種模式下大黃魚幼魚消化道共有的菌屬為59個。并且，19個相對豐度高于1%的菌屬中，除Flavisolibacter外，其余菌屬均為共有均屬。因此，將發光桿菌屬、乳桿菌屬、弧菌屬、魏斯氏菌屬等18個菌屬視為兩種養殖模式下大黃魚幼魚消化道的共有優勢菌群。

圖5顯示了兩種環境條件下大黃魚幼魚消化道中豐度差異顯著的菌屬。其中，網箱養殖幼魚消化道Flavitalea、海單胞菌屬（Marinomonas）、Roseovarius和假單胞菌屬（Pseudomonas）等的豐度顯著低于工廠化養殖的（P＜0.05），而氣單胞菌屬（Aeromonas）、Esche?richia_Shigella、根瘤菌屬（Rhizobium）、Psychrilyo?bacter和黃單胞菌屬（Xanthomonas）的豐度顯著高于工廠化養殖的（P＜0.05）。

圖3 不同養殖模式下大黃魚幼魚消化道優勢菌屬

圖4 不同養殖模式下大黃魚幼魚消化道微生物群韋恩圖

2.3 消化道微生物群與環境菌群的相關性

以每個樣本三個平行共有菌屬為基礎，對工廠化養殖大黃魚幼魚消化道菌群與環境菌群相關性進行分析。消化道的微生物物種數目為84，與養殖用水共有物種42個，與餌料共有物種55個，三者共有物種34個，而消化道特有物種21個（見圖6）。

同樣以平行樣本共有物種為基礎，網箱養殖大黃魚幼魚消化道微生物物種數目為95，與水共有物種僅20個，而與餌料共有物種卻高達65個，并且三者共有物種僅17個（圖7）。

圖5 兩種養殖模式下大黃魚幼魚消化道差異顯著菌屬(P＜0.05)

圖6 工廠化養殖大黃魚幼魚消化道菌群、餌料菌群與環境菌群的韋恩圖

圖7 網箱養殖大黃魚幼魚消化道菌群、餌料菌群與環境菌群的韋恩圖

在大黃魚幼魚消化道微生物群與環境菌群的主成分分析中可以看出，主成分1（PC1）貢獻率84%，主成分2（PC2）的貢獻率為9.6%（圖8）。相對于網箱養殖大黃魚消化道樣本，工廠化養殖的消化道樣本比較聚集，說明消化道微生物群結構較為穩定。同時，相對與水樣本而言，消化道樣本與餌料樣本相距較近，說明餌料中的微生物群組成與消化道的較為相似。

2.4 大黃魚消化道微生物群功能分析

基于各樣本的KEGG比對，共獲得299個功能途徑，對基因豐度排列前十五的進行分析，可以看出兩種模式下大黃魚幼魚消化道微生物群功能在第一層級主要由環境信息處理、遺傳信息處理、新陳代謝和細胞過程四大類組成（圖9）。其中，三級水平下，參與環境信息加工的轉運蛋白功能的基因數目最多，ABC轉運蛋白的次之。另外，參與肽酶、氨基酸相關酶功能的基因數目也相對較高，為35～56萬個。在這些優勢的代謝通路中，網箱養殖大黃魚消化道微生物群基因豐度明顯低于工廠化養殖的，但差異均不顯著（P＞0.05）。

圖8 大黃魚幼魚消化道菌群與環境菌群PCA分析

圖9 大黃魚幼魚消化道菌群功能注釋

針對第一層級通路中的新陳代謝通路進行對比分析，在第二層級水平，大黃魚消化道微生物群參與的功能按照基因豐度由高到低的順序主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶因子和維生素代謝、核苷酸代謝、脂類代謝、異生物質生物降解與代謝、多糖生物合成與代謝、酶家族等（見圖10）。在所有的新陳代謝通路中，網箱養殖大黃魚消化道微生物群基因豐度同樣低于工廠化養殖的，差異不顯著（P＞0.05）。

圖10 大黃魚幼魚消化道菌群新陳代謝功能的分類注釋

3 討論

3.1 大黃魚幼魚消化道微生物群結構特征及其與環境微生物的相關性

本研究中，屬水平下，所有消化道樣本的優勢物種的豐度和比較相近，且均低于60%，反映出物種組成的均一性比較高。同時，網箱養殖大黃魚幼魚消化道菌群的物種數目及香濃指數均高于工廠化養殖模式的，說明網箱養殖大黃魚消化道微生物群的多樣性比較高，但差異不明顯。在兩種養殖模式下，大黃魚幼魚消化道微生物群在門和屬水平的主要組成基本相似，并且工廠化養殖大黃魚消化道微生物結構相對穩固。在物種共有性分析時，發現本研究中18個豐度高于1%的菌屬為兩種模式養殖大黃魚消化道的共有優勢物種，說明這些菌群可能始終存在于大黃魚消化道中，受環境和自身因素的影響，其豐度會出現一定的變化，導致其中一些菌屬（氣單胞菌屬、假單胞菌屬等）的豐度產生顯著性差異，但其豐度并不是很高。李存玉等[16]在對工廠化和池塘養殖牙鲆腸道菌群結構對比分析中，同樣發現，工廠化養殖的牙鲆腸道微生物多樣性比較低；并且，兩種模式下養殖牙鲆腸道優勢物種組成在門和屬水平上基本相似，只是物種豐度存在一定的差異。關于仿刺參腸道菌群結構對比分析中，有研究指出，池塘養殖和海上吊籠養殖的腸道菌群的結構存在較大差異[17]。這可能與養殖動物的種類、攝食習性等有關[18]。

通過PCR與克隆技術相結合，王程程等[19]對同一養殖海區的1齡大黃魚進行研究，發現擬桿菌屬為其腸道內的最優勢菌屬。而本實驗中，在工廠化和網箱兩種模式下大黃魚幼魚消化道中，擬桿菌屬雖為優勢物種，但是豐度并不是最高的。這可能與生存環境、營養水平、魚體自身的生理階段及研究方法有關[9，18，20-24]。

水產養殖中，水和餌料是外源性物質的良好載體，包括益生菌和病原菌在內的微生物均可借助于這兩種介質進入養殖動物體內形成相應的效應[25-28]。本實驗中，分別對兩種環境因素與消化道菌群的相關性進行了分析。兩種模式養殖大黃魚消化道與餌料共有菌屬的數目明顯高于水環境的；并且，與水環境相比，大黃魚消化道菌群的組成與分布與餌料的更為相似，揭示了對兩種模式養殖大黃魚幼魚而言，餌料中微生物群對消化道菌群的影響較為明顯。同時，大黃魚消化道也有自己的特有物種，推測其可能與親本、授精過程或者微生物間的相互作用有關。相關報道指出，大菱鲆、牙鲆苗種繁育階段，與水中微生物相比，餌料微生物與仔稚幼魚腸道菌群的結構更相關[29-30]。但是，Bakke等[7]在對鱈魚幼魚消化道菌群的研究中發現，與餌料相比，消化道菌群結構與水中的微生物組成比較相似，這可能與研究的方法、魚的種類及生存環境有關。

3.2 大黃魚幼魚消化道微生物群功能

消化道微生物群是一個復雜的群體，通過相互間的各種作用使整個群體處于動態的平衡狀態，有效預防外源菌群的定植[31]。因此，針對消化道菌群調控方面的研究逐步開展內源性菌群的挖掘與深入研究。從而，糞菌移植、“菌群-腸-行為軸”等成為醫學界研究的焦點[32-35]。Shabat等[36]通過研究證實反芻動物能量的吸收依賴于消化道特異的微生物組。還有報道指出，消化道微生物組能夠在機體能量獲取與消耗方面協同宿主更好的適應高海拔的生活環境[37]。本研究中，兩種模式養殖大黃魚幼魚消化道主要菌群結構基本相似，僅有少數豐度較低的菌屬存在一定差異。因此，消化道微生物群的主要功能也基本相似，在新陳代謝中，參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝等功能占據主要優勢地位。另外，參與能量代謝、輔酶因子和維生素代謝、脂類代謝等的微生物基因豐度也比較高。說明消化道微生物群在滿足自身生長發育需要的同時，對宿主營養代謝也發揮著重要的作用。兩種模式養殖大黃魚幼魚來源于同一批受精卵孵化的仔魚，并且取樣過程完全隨機，投喂的餌料也相同，最終體重存在一定差距，這可能與養殖密度差距懸殊相關。在工廠化養殖模式下，幼魚的養殖密度為網箱養殖的22.7倍，相比較而言對幼魚的各種生長機制形成一定的脅迫。為了彌補養殖密度對魚體自身的生長機制的不足，消化道菌群通過對結構的細微調整來形成一種對魚體生長代謝的補償作用，最終表現為參與主要代謝通路及新陳代謝各通路的消化道微生物群基因的豐度均高于網箱養殖幼魚的。

4 結論

工廠化和網箱養殖大黃魚幼魚消化道微生物群優勢物種組成基本相似，其中，假單胞菌屬、氣單胞菌屬和Escherichia_Shigella在兩種養殖模式幼魚消化道中的豐度差異顯著（P＜0.05）。并且，幼魚消化道菌群與餌料中的相關性比較大。兩種模式養殖幼魚消化道菌群基因參與的主要功能相近，但是工廠化模式養殖幼魚消化道菌群參與這些主要功能的基因豐度高于網箱模式養殖幼魚的，這可能是對幼魚生長代謝在密度脅迫中的一種補償作用。