基于90K芯片SNP標記的小麥遺傳圖譜構建及抗紋枯病QTL定位

崔德周 李永波 樊慶琦 隋新霞 黃承彥 楚秀生

摘要：為挖掘定位小麥抗紋枯病QTL，以萊州953×山農輻63的F?2∶?3為作圖群體，用Illumina Wheat 90K芯片檢測F?2單株的基因型，并用QTL IciMapping 4.1軟件繪制該群體的遺傳連鎖圖譜;在自然發病條件下，鑒定分離群體的抗、感表型，利用QTL IciMapping 4.1進行抗紋枯病QTL定位分析。結果表明，構建的小麥遺傳連鎖圖譜包含21個連鎖群，覆蓋了小麥的21條染色體，圖譜總長度5 528.12 cM，平均圖距5.25 cM;共檢測到6個分布于小麥1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上的加性QTL位點，單個QTL的貢獻率為3.24%～10.37%。該結果可為小麥抗紋枯病QTL精細定位與相關基因克隆奠定基礎，也為小麥抗紋枯病分子標記輔助選擇育種提供了理論依據。

關鍵詞：小麥;遺傳連鎖圖譜構建;紋枯病;QTL定位;90K芯片SNP標記

中圖分類號：S512.103.53文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0013-05

Construction of Wheat Genetic Linkage Map Based on 90K SNP

Array and Mapping QTLs for Sharp Eyespot Resistance

Cui Dezhou??Li Yongbo??Fan Qingqi??Sui Xinxia??Huang Chengyan??Chu Xiusheng1，2

（1. Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of

Wheat Biology and Genetic Improvement in the North Yellow﹠Huaihe River Valley， Ministry of Agriculture/

National Engineering Laboratory for Wheat and Maize， Jinan 250100， China;

2. College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

AbstractIn order to map the QTLs associated with sharp eyespot resistance in wheat， the F?2∶?3 population was derived from a combination of Laizhou 953 × Shannongfu 63. The genotype of F2 single plant was obtained through the Illumina Wheat 90K SNP array， and the genetic linkage map of the population was constructed using QTL IciMapping 4.1 software. The phenotype of the population was identified under natural conditions， and the QTL mapping was performed by using QTL IciMapping 4.1 software. The genetic linkage map was composed of 21 linkage groups， covering 21 chromosomes of wheat， with a total length of 5 528.12 cM and an average spacing of 5.25 cM. A total of 6 additive QTLs were detected out， which distributed on chromosome 1A， 1B， 2A， 3A， 7A and 7D with the contribution rate of 3.24%～10.37%. The results would lay a foundation for the fine mapping and cloning of QTLs associated with wheat sharp eyespot resistance， and provide basis for molecular marker assisted selection breeding in wheat.

KeywordsWheat; Genetic linkage map construction; Sharp eyespot disease; QTL mapping; 90K SNP array

小麥紋枯病又稱白穗病（white head）、尖眼斑病（sharp eyespot），主要是由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）的第一菌絲融合群（CAG-1）以及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的第四、五融合群（AG-4、AG-5）引起的一種土傳病害，已成為我國長江流域和黃淮麥區的主要病害之一，對山東省小麥的危害已超過白粉病，由次要病害升級為主要病害。該病主要破壞小麥的莖、葉鞘等輸導組織和機械組織，阻礙營養物質的運輸，降低植株的抗倒伏能力，嚴重時還會引起籽粒皺縮和白穗，一般造成減產10%～30%，嚴重地塊減產可超過50%[1]。因此，選育和推廣抗紋枯病小麥新品種，是解決小麥紋枯病危害最直接、最有效的途徑，而抗病品種的培育得益于紋枯病抗性基因的挖掘與利用。

從遺傳學上來講，作物抗病性是由多個數量性狀位點（quantitative trait loci，QTL）控制的性狀，遺傳機理復雜。通過構建分子標記遺傳連鎖圖譜定位抗病QTL，進而明確其在相應遺傳背景下的作用強度和作用方式，對植物抗病育種有著十分重要的意義。國內外學者在水稻、大麥、小麥、玉米等多種作物上均定位到抗病QTL[2-5]。就小麥抗紋枯病QTL而言，最早見于霍納新的相關報道，其利用SSR與AFLP標記共檢測到3個成株期QTL和6個苗期QTL [6]。而后，蔡士賓等[7]用ARz×揚麥158的RIL群體為材料，釆用單標記方差分析法，發現11個SSR標記與抗病表型顯著相關，能解釋表型變異的5.0%～13.0%。Chen等[8]用美國抗病品種Luke與國內抗病品系AQ24788-83構建RIL群體，在溫室和大田兩種環境下，共檢測到11個抗紋枯病QTL，其中7個在不同環境條件下均穩定地表現抗病作用;然而該研究利用兩個抗病親本組配分離群體，在后續QTL分析過程中容易漏掉在雙親中共同表達的抗病QTL。Wu等[9]以抗病材料CI12633和感病品種揚麥9號為親本，構建分離群體，共鑒定到5個抗病QTL，同時發現小麥紋枯病抗性與抽穗期以及分蘗角度呈顯著負相關，與基部第一節間和第二節間的直徑呈顯著正相關。

雖然前人研究中已得到了一批抗性QTL，但檢測到的QTL存在連鎖圖譜密度低、QTL區段大以及有些QTL供體親本在生產上難以直接利用等問題，導致目前還沒有抗性QTL在小麥育種中成功利用的報道。本研究以前期鑒定到的農藝性狀優良的抗紋枯病材料萊州953和感病材料山農輻63為親本組配分離群體，以高通量的SNP標記構建連鎖圖譜，定位控制紋枯病抗性的QTL，為小麥抗紋枯病QTL定位和基因克隆奠定基礎，同時為小麥抗紋枯病分子標記輔助選擇育種及種質創新提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料

以農藝性狀優良的抗紋枯病品種萊州953為父本、高感紋枯病品種山農輻63為母本進行雜交，構建含170個株系的F?2∶?3群體，由山東省農業科學院作物研究所小麥種質創新與利用團隊創制并保存。

1.2田間種植及抗性鑒定

2016—2017年度將F?2∶?3分離群體及其親本種植于山東省臨沂市紋枯病鑒定圃，每個株系種植2行，2次重復，行長2 m，行距0.25 m，株距3.0 cm。田間管理參照當地一般大田。4月中旬調查發病情況，病級劃分按照0～5級分級標準[10]。每重復隨機取20個莖調查紋枯病感病性，并計算平均病級。

1.3基因型分析

用植物基因組DNA提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）提取親本和F?2各單株的DNA。小麥90K SNP標記，由北京康普森生物技術有限公司利用Illumina SNPGenotyping技術測試平臺、依靠微珠芯片技術（Bead Array）進行檢測，并利用GenomeStudio v1.0軟件進行SNP多態性分析。

1.4構建遺傳連鎖圖譜

篩選多態性標記后，將分離群體基因型數據導入QTL IciMapping 4.1軟件，利用BIN程序去除冗余標記，然后利用MAP程序構建該群體的遺傳連鎖圖譜。

1.5QTL定位

結合連鎖圖譜與抗病表型數據，采用基于完備區間作圖法QTL IciMapping 4.1軟件的BIP程序進行加性QTL檢測，設LOD閾值為2.5。QTL命名方法按照QTL+性狀+染色體命名，其中，QTL以Q表示，性狀以英文縮寫表示且僅首字母大寫（Ses）。

2結果與分析

2.1小麥遺傳連鎖圖譜的構建

本研究采用的90K芯片包含81 577個SNP標記，覆蓋小麥21條染色體。其中，在雙親間共檢測到4 378個多態性位點，利用IciMapping 4.1的BIN程序刪除冗余標記后，共有1 052個標記用于遺傳連鎖圖譜的繪制。該圖譜全長5 528.12 cM，平均圖距5.25 cM。分布于小麥A、B和D染色體組的標記數分別為412、530、110個，連鎖長度分別為1 737.73、2 412.62、1 377.77 cM，D染色體組標記數最少、平均圖距最長。同源群中，第1同源群遺傳長度最長，第4同源群標記數目最少、平均圖距最短（表1）。

2.2小麥作圖群體及其親本的紋枯病抗性分析

2016—2017年度，在紋枯病鑒定圃中，對F?2∶?3分離群體及其親本進行田間抗性鑒定，記錄病級。結果（表2）表明，抗病親本萊州953對紋枯病抗性較強（平均病級為1.30），感病親本山農輻63高感紋枯病（平均病級為4.56），F?3家系的平均病級范圍為1.05～4.75，呈連續性分布，符合數量遺傳特征。

2.3小麥抗紋枯病QTL分析

利用QTL IciMapping 4.1軟件的完備區間作圖法進行QTL檢測，在LOD值>2.5水平下，共定位到6個QTL位點，分布于小麥的1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上（表3和圖1），單個QTL可解釋表型變異的3.24%～10.37%。其中，1A染色體上檢測到的QTL ?QSes1A?位于標記IAAV3695-BS00103166_51之間，貢獻率大于10%，為主效QTL，其加性效應值為-0.60，表明該QTL抗紋枯病的等位基因來自抗病親本萊州953。QTL ?QSes3A?和?QSes7D?分別定位于3A和7D染色體上，可解釋抗病表型變異分別為9.55%和9.49%，加性效應值均為負值，表明其控制紋枯病抗性的等位基因來源于親本萊州953。另外3個QTL，?QSes1B?、?QSes2A?和?QSes7A?，貢獻率相對較低，且抗性等位基因來源于山農輻63。

3討論

QTL定位結果準確可靠的前提條件是構建高質量的遺傳連鎖圖譜。與傳統的分子標記RFLP、AFLP、RAPD和SSR相比，SNP標記具有數量多、分布廣、通量高等優點，是目前認可度最高的分子標記[10]。本研究利用小麥Illumina 90K SNP芯片，檢測出雙親間具有多態性的位點4 378個，刪除冗余標記后，用1 052個標記構建遺傳連鎖圖譜，構建的圖譜長度高于用傳統的分子標記構建的圖譜。隨著小麥基因組數據庫的完善，SNP標記將在小麥基因定位、候選基因預測、基因克隆等方面扮演更重要的角色[11，12]。

在本圖譜1 052個標記中，B基因組標記數目最多、圖譜最長，D基因組標記數目最少、圖譜最短。這與張傳量等[13]以小偃81 × 周8425B和小偃81 × 西農1376兩個組合的RIL群體構建的圖譜趨勢一致，表明90K芯片SNP標記在小麥染色體組A、B和D間分布不均衡。D染色體組標記數目少，主要是因為在小麥進化過程中，D基因組加入較晚，沒有產生充分的基因交流，故而保守性較高[14，15]。

前人研究表明，小麥抗紋枯病QTL主要分布在1A、2B、6B和7D染色體上[6-9， 16，17]。本研究共定位到6個QTL位點，分別位于小麥的1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上。其中，僅有位于1A染色體上的?QSes1A?為主效QTL。其他QTL貢獻率都在10%以下，進一步表明小麥對紋枯病的抗性是由多個微效基因共同控制的，屬于典型的數量性狀。

本研究發現，?QSes1B、QSes2A和QSes7A?這3個QTL的貢獻率分別為8.70%、3.76%和3.24%，其抗性等位基因來源于感病親本山農輻63。這種現象在作物抗旱性QTL定位研究中也有報道[18，19]，如在濰麥8號與濟麥20組配的RIL群體中，位于4A染色體上的兩個QTL ?QSLDWR-WJ-4A和QCLR-WJ-4A?，其抗旱增效基因來源于抗旱性差的濰麥8號，表明抗性差的材料在某些位點上也可能存在相應的抗性增效基因，這也正是通過雜交聚合能夠培育抗性優良作物新品種的理論基礎，同時為抗病遺傳改良中雜交親本的選擇拓寬了新的思路。

4結論

本研究基于90K芯片SNP標記，繪制了一張長度5 528.12 cM、具有1 052個標記的小麥遺傳連鎖圖譜。在此基礎上，定位到分布于小麥1A、1B、2A、3A、7A和7D染色體上的6個加性抗紋枯病QTL位點，其中來源于抗病親本萊州953、位于1A染色體的 ?QSes1A?為抗紋枯病主效QTL。本研究結果可為小麥抗紋枯病QTL精細定位、相關基因克隆以及小麥抗紋枯病遺傳改良奠定基礎。

參考文獻：

[1]路妍， 張增艷， 任麗娟， 等. 轉?Rs-AFP2?基因小麥的分子分析及其紋枯病抗性[J]. 作物學報， 2009， 35（4）： 640-646.

[2]Ashkani S， Rafii M Y， Shabanimofrad M， et al. Molecular breeding strategy and challenges towards improvement of blast disease resistance in rice crop[J]. Front. Plant Sci.， 2015， 6：886.

[3]Huang Y， Haas M， Heinen S， et al. QTL mapping of fusarium head blight and correlated agromorphological traits in an elite barley cultivar Rasmusson [J]. Front. Plant Sci.， 2018， 9：1260.

[4]Lin X， NDiaye A， Walkowiak S， et al. Genetic analysis of resistance to stripe rust in durum wheat （Triticum turgidum L. var. durum） [J]. PLoS ONE， 2018， 13（9）： e0203283.

[5]Lanubile A， Maschietto V， Borrelli V M， et al. Molecular basis of resistance to fusarium ear rot in maize [J]. Front. Plant Sci.， 2017， 8：1774.

[6]霍納新. 小麥紋枯病、白粉病抗性QTL分析[D]. 北京：中國農業科學院， 2002.

[7]蔡士賓， 任麗娟， 顏偉， 等. 小麥紋枯病種質創新及QTL定位的初步研究[J]. 中國農業科學， 2006， 39（5）： 928-934.

[8]Chen J， Li G， Du Z， et al. Mapping of QTL conferring resistance to sharp eyespot （Rhizoctonia cerealis） in bread wheat at the adult plant growth stage [J]. Theor. Appl. Genet.， 2013， 126（11）： 2865-2878.

[9]Wu X， Cheng K， Zhao R， et al. Quantitative trait loci responsible for sharp eyespot resistance in common wheat CI12633 [J]. Sci. Rep.， 2017， 7（1）： 11799.

[10] Wang S， Wong D， Forrest K， et al. Characterization of polyploid wheat genomic diversity using a high-density 90，000 single nucleotide polymorphism array [J]. Plant Biotechnol. J.， 2014， 12（6）： 787-796.

[11] Rasheed A， Hao Y， Xia X， et al. Crop breeding chips and genotyping platforms： progress， challenges， and perspectives [J]. Mol. Plant， 2017， 10（8）： 1047-1064.

[12] 許陶瑜， 唐朝暉， 王長彪， 等. SNP標記在小麥遺傳育種中的應用研究進展[J]. 山西農業科學， 2017， 45（9）： 1549-1552.

[13] 張傳量， 簡俊濤， 馮潔， 等. 基于90K芯片標記的小麥芒長QTL定位[J]. 中國農業科學， 2018， 51（1）： 17-25.

[14] 肖靜， 田紀春. 小麥（T. aestivum L.） D基因組的研究進展[J]. 分子植物育種， 2008， 6（3）： 537-541.

[15] 賈繼增， 張正斌， Devos K， 等. 小麥21條染色體RFLP作圖位點遺傳多樣性分析[J]. 中國科學： 生命科學， 200?31（1）： 13-21.

[16] 任麗娟， 張旭， 周淼平， 等. 小麥抗紋枯病和赤霉病QTL定位研究[J]. 麥類作物學報， 2007， 27（3）： 416-420.

[17] 蔣彥婕， 朱芳芳， 蔡士賓， 等. 小麥紋枯病抗性QTL遺傳分析[J]. 江蘇農業學報， 2014， 30（6）： 1222-1226.

[18] Wang Y， Zhang Q， Zheng T，et al. Drought-tolerance QTLs commonly detected in two sets of reciprocal introgression lines in rice [J]. Crop Pasture Sci.， 2014， 65（2）： 171-184.

[19] 劉新元， 張紅， 胡雪薇， 等. 小麥萌發期幼苗相關性狀耐旱系數的QTL定位[J]. 核農學報， 2017， 31（2）： 209-217.