楊樹枯萎病菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

灑榮波 晁強(qiáng) 王曉輝 隋君康 劉訓(xùn)理

摘要：為建立熒光定量PCR檢測楊樹枯萎病的方法和明確前期分離的拮抗菌N6-34對楊樹枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌的作用，本試驗(yàn)采用常規(guī)PCR法擴(kuò)增尖孢鐮刀菌的特異性片段，將此片段與載體連接構(gòu)建質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA在實(shí)時熒光定量PCR儀上采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增并繪制實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時對楊樹進(jìn)行不同灌根處理（T1：1×106 cfu/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸液和未接N6-34菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液各20 mL;T2：1×106 cfu/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸液和滅活的N6-34菌株發(fā)酵培養(yǎng)液各20 mL;T3：1×106cfu/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸液和N6-34菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液各20 mL），并于10、20、30 d取樣檢測楊樹根際尖孢鐮刀菌數(shù)量。結(jié)果表明：本研究建立的方法能應(yīng)用于土傳尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的楊樹枯萎病的檢測;T1處理的尖孢鐮刀菌的數(shù)量隨處理時間的延長呈先下降后上升的趨勢，T2和T3中的尖孢鐮刀菌數(shù)量則呈下降趨勢，表明N6-34能夠抑制尖孢鐮刀菌。本研究對指導(dǎo)楊樹種植和病害預(yù)報具有極為重要的應(yīng)用價值，能夠?yàn)闂顦洳『芾硖峁┛茖W(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：熒光定量PCR;楊樹枯萎病;尖孢鐮刀菌;定量檢測

中圖分類號：S763.15文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0131-05

Establishment and Application of a Real-Time Fluorescent

Quantitative PCR Method for Detection of Poplar Wilt Pathogen

Sa Rongbo??Chao Qiang??Wang Xiaohui3， Sui Junkang3， Liu Xunli2

（1. College of Life Sciences， Taishan Medical University， Taian 271016， China;

2. Forestry College of Shandong Agricultural University， Taian 271018， China;

3. College of Life Sciences of Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

AbstractThis study was aimed to construct a real-time fluorescent quantitative PCR method for detection of poplar wilt pathogen and make clear of the effect of antagonistic bacterium N6-34 isolated earlier on Fusarium oxysporum. The specific fragment amplified by routine PCR was lingated with the vectors to constrct the plasmid， and then the plasmid DNA was extracted and amplified by two-step method on a real-time fluorescent quantitative PCR instrument. The stantard curve of real-time fluorescent quantitative PCR was also obtained. In addition， an experiment was conducted by irrigating root of poplar with different solutions. Three treatments were designed as T1 （20 mL of 1×106 cfu/mL Fusarium oxysporum spore suspension and 20 mL of fermented culture solution with no N6-34）， T2 （20 mL of 1×106 cfu/mL Fusarium oxysporum spore suspension and 20 mL of fermented culture solution with inactivated N6-34） and T3 （20 mL of 1×106 cfu/mL Fusarium oxysporum spore suspension and 20 mL of fermented culture solution with activated N6-34）. The quantity of Fusarium oxysporum at the rhizosphere of poplar was detected after treated for 10， 20 and 30 days. The results showed that the real-time fluorescent quantitative PCR method established in this study could be used for the detection of poplar wilt caused by soil-borne Fusarium oxysporum. The quantity of Fusarium oxysporum decreased first and then increased under the T1 treatment， and decreased under the T2 and T3 treatments， which indicated that the antagonistic bacterium N6-34 could inhibit Fusarium oxysporum. This study would have very important application value for guiding poplar planting and disease prediction， and could provide scientific bases for poplar disease management.

KeywordsFluorescent quantitative PCR; Poplar wilt; Fusarium oxysporum; Quantitative detection

楊樹作為世界上實(shí)用性最強(qiáng)的樹種之一，具有速生、豐產(chǎn)、高效的特性，其分布十分廣泛，主要生長于亞寒帶地區(qū)及亞洲、歐洲、北美洲的部分地區(qū)[1，2]。其樹體高大，體內(nèi)水分充足，葉寬且多，易發(fā)生病蟲危害，因而防治形勢異常嚴(yán)峻[3]。據(jù)統(tǒng)計，危害楊樹的病害有300多種，包括楊樹潰瘍病、枯萎病、爛皮病、黃化病、花葉病、葉銹病、白粉病等[4-7]。楊樹枯萎病是一種重要的土傳病害，病原菌在土壤中生存和積累，發(fā)病逐年加重，可引起楊樹成片枯萎死亡。尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起楊樹枯萎病的發(fā)生[8-10]。隨著全球生態(tài)環(huán)境的惡化，楊樹的病害種類也在逐漸增加，并有擴(kuò)散蔓延的趨勢。

本實(shí)驗(yàn)室從楊樹中分離獲得一株內(nèi)生拮抗細(xì)菌N6-34。前期研究表明，該菌株發(fā)酵性狀優(yōu)異、拮抗效果好、抗菌譜廣，對楊樹潰瘍病菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌等多種病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用[11]。本研究利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)建立尖孢鐮刀菌的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，對不同處理下的楊樹根際土壤中尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量檢測，并分析N6-34對該致病菌的抑制作用，以期為楊樹枯萎病的診斷提供快速準(zhǔn)確的檢測方法，同時為該病的防治提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株：N6-34由本實(shí)驗(yàn)室從泰山林地健康楊樹樹皮中分離獲得，甘油管保存于-80℃超低溫冰箱中;尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2試劑與儀器

10×Loading Buffer、dNTP、DNA Marker、Taq DNA Polymerase，購自德泰生物科技（南京）有限公司。尖孢鐮刀菌特異性引物JBf： 5′-CATACCACTTGTTGTCTCGGC-3′，JBr： 5′-GAACGCGAATTAACGCGAGTC-3′，由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司合成。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

基因擴(kuò)增PCR儀LNB96，上海皓莊儀器有限公司生產(chǎn);iQ5實(shí)時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn);全溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-F160，常州恒隆儀器有限公司生產(chǎn);電熱恒溫水浴鍋HWS-24，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);自動電熱壓力蒸汽滅菌器KYQL-RXS，濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.3實(shí)時熒光定量PCR方法的建立

1.3.1尖孢鐮刀菌基因組DNA的提取按照真菌基因組DNA提取試劑盒操作。

1.3.2尖孢鐮刀菌特異性片段的擴(kuò)增以提取的DNA作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Taq PCR MasterMix 2.0 μL，JBf1.0 μL，JBr 1.0 μL，DNA 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃ 變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);72℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗(yàn)證是否為目的片段。

1.3.3尖孢鐮刀菌特異性片段膠回收純化將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，在凝膠成像分析系統(tǒng)下，用手術(shù)刀將目的條帶膠條切下，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

1.3.4尖孢鐮刀菌目的片段的連接與轉(zhuǎn)化將尖孢鐮刀菌特異性片段與載體連接。其反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物1.5 μL，pEASY-T1 Cloning Vector 1 μL，ddH2O 2.5 μL;室溫下反應(yīng)5 min，完成載體與目的片段的連接即質(zhì)粒的構(gòu)建。將構(gòu)建好的質(zhì)粒與大腸桿菌經(jīng)冰浴、熱擊、冷卻后加入不含氨芐青霉素的適量LB液體培養(yǎng)基，于37℃下振蕩培養(yǎng)1 h，取適量菌液涂布在含50 mg/L的氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16～24 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.3.5質(zhì)粒提取陽性克隆的質(zhì)粒提取參照質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書進(jìn)行，使用超微量核酸蛋白測定儀檢測提取質(zhì)粒DNA濃度。

1.3.6實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將質(zhì)粒DNA進(jìn)行102、103、104、105、106和107倍梯度稀釋，并以此為模板，在實(shí)時熒光定量PCR儀上采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL，JBf 0.4 μL，JBr 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s;94℃ 變性5 s，60℃ 退火 30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。溶解曲線步驟為：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線和溶解曲線。擴(kuò)增結(jié)束后由儀器內(nèi)置軟件繪制溶解曲線，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)粒濃度與質(zhì)粒拷貝數(shù)的換算公式如下：

質(zhì)粒拷貝數(shù)（copies/μL）=質(zhì)粒濃度×6.02×1023/[（載體長度+片段長度）×660]

1.4楊樹根際尖孢鐮刀菌數(shù)量監(jiān)測

將扦插3月后長勢一致的楊樹苗移至直徑30 cm的花盆中進(jìn)行不同的灌根處理，其中，T1：1×106 cfu/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸液和未接N6-34菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液各20 mL;T2：1×106 cfu/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸液和滅活的N6-34菌株發(fā)酵培養(yǎng)液各20 mL;T3：1×106cfu/mL的尖孢鐮刀菌孢子懸液和N6-34菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液各20 mL。分別于10、20、30 d采集加菌處理后的楊樹幼苗根際土壤，提取土壤總DNA（參照北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的土壤DNA提取試劑盒D2500說明書進(jìn)行操作）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，比較各反應(yīng)體系達(dá)到一定熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得處理樣品中尖孢鐮刀菌的質(zhì)粒濃度，從而計算出尖孢鐮刀菌在楊樹根際土壤中的絕對拷貝數(shù)。

根際土壤中尖孢鐮刀菌拷貝數(shù)的計算公式：

Ct=algX+b。

式中：X為1 μL DNA樣品中的拷貝數(shù);Ct為擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值時經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù);a、b為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的常數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1尖孢鐮刀菌質(zhì)粒樣品的制備

利用尖孢鐮刀菌的特異性引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增得到長度為350 bp左右的特異性片段（圖1），將此特異性片段利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收，利用超微量核酸蛋白檢測儀測定回收后的DNA濃度為70.30 ng/μL。

藍(lán)白斑篩選結(jié)果如圖2所示。隨機(jī)挑取幾個白色菌落，在LB培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用超微量核酸蛋白檢測儀檢測質(zhì)粒DNA的濃度為179.30 ng/μL，A?260/A?280=1.84。

2.2實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)計算，濃度為179.30 ng/μL的質(zhì)粒拷貝數(shù)為3.8×1010 copies/μL。經(jīng)稀釋分別得到系列梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（對應(yīng)的拷貝數(shù)為3.8×108、3.8×107、3.8×106、3.8×105、3.8×104、3.8×103 copies/μL），分別進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。以各梯度拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以各梯度Ct值為縱坐標(biāo)構(gòu)建實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.3029，R2為0.9953。擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物單一（圖4）。

2.3楊樹根際尖孢鐮刀菌的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果

土壤總DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。以土壤DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測尖孢鐮刀菌在楊樹根際的生長情況，結(jié)果如表1所示。可以看出，T1中尖孢鐮刀菌的拷貝數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，第10 d時楊樹根際土中的尖孢鐮刀菌數(shù)量為35.3×105 copies/g，第20 d時下降為11.4×105 copies/g，第30 d時數(shù)量升高到28.4×105 copies/g。T2和T3的尖孢鐮刀菌數(shù)量變化規(guī)律相同，均為下降趨勢。不同處理相同時間下土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量差異顯著。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對楊樹根際土壤尖孢鐮刀菌的動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，T1中尖孢鐮刀菌的拷貝數(shù)呈先下降后上升的趨勢，推測原因是尖孢鐮刀菌剛施入土壤后先維持一段時間的高濃度，隨后大部分尖孢鐮刀菌死亡，但再經(jīng)過一段時間，存活的尖孢鐮刀菌會在楊樹根際穩(wěn)定定殖，數(shù)量上升并保持在一個穩(wěn)定水平。T3中尖孢鐮刀菌數(shù)量變化充分說明N6-34菌株對尖孢鐮刀菌的抑制作用，同時也證明N6-34菌株能在楊樹根際穩(wěn)定定殖。由于T2加入滅活的發(fā)酵液，發(fā)酵液中已經(jīng)產(chǎn)生活性物質(zhì)，活性物質(zhì)同樣可以抑制尖孢鐮刀菌，但由于活性物質(zhì)的量是固定的，隨著時間的延長活性物質(zhì)的量越來越少，因此限制了對尖孢鐮刀菌的抑制效果。

傳統(tǒng)的土壤中病原微生物的定量一般采用選擇性培養(yǎng)基將病原微生物從土壤中分離培養(yǎng)后進(jìn)行確定[12]。但這種方法工作量大，且只能對可培養(yǎng)微生物進(jìn)行定量，而土壤中99%的微生物是不可培養(yǎng)的，因此不能準(zhǔn)確反映土壤中病原微生物的真實(shí)數(shù)量。而利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)可以不通過病原微生物的分離培養(yǎng)直接對土壤中病原微生物進(jìn)行定量檢測[13]。本研究建立了利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對楊樹枯萎病原尖孢鐮刀菌的定量方法，證實(shí)前期分離的拮抗菌N6-34對楊樹枯萎病菌尖孢鐮刀菌的抑制作用。因此，本研究建立的方法能夠應(yīng)用于土傳尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的楊樹枯萎病的檢測，并且本研究結(jié)果對指導(dǎo)楊樹種植和病害預(yù)報具有極為重要的應(yīng)用價值，能夠?yàn)闂顦洳『芾硖峁┛茖W(xué)依據(jù)。

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