銀杏內酯K的制備工藝研究

崔龍 胡少銀 高進等

[摘要] 目的 優選銀杏內酯K的制備工藝。 方法 以銀杏內酯B為原料，以銀杏內酯B的收率為指標，考察投料比（銀杏內酯∶二乙氨基三氟化硫）、反應溶劑用量比（銀杏內酯∶二氯甲烷）、反應時間、反應溫度，采用正交試驗設計優選銀杏內酯K的最佳制備工藝條件，并采用波譜法鑒定其結構，高效液相色譜法測定其含量，色譜條件為：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：水-甲醇-異丙醇（60∶35∶5）;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：220 nm。 結果 銀杏內酯K的最佳制備工藝條件為投料比1∶4.5，反應溶劑用量比1∶30，反應時間20 min，反應溫度4℃;所得目標化合物經Q-TOF-MS、1H-NMR、13C-NMR和二維核磁共振譜鑒定為銀杏內酯K。 結論 該制備工藝條件溫和、制備周期短、操作簡便、收率高，適合工業化生產。

[關鍵詞] 銀杏內酯;銀杏內酯K;氟化試劑;結構鑒定

[中圖分類號] R283? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）02（a）-0043-04

[Abstract] Objective To optimize the preparation process of ginkgolide K. Methods Taking ginkgolide B as raw material， the yield of ginkgolide B as index， the ratio of feed （ginkgolide ∶ diethylaminotrifluoride）， the ratio of reaction solvent （ginkgolide ∶ dichloromethane）， reaction time and reaction temperature were investigated. The optimum preparation conditions of ginkgolide K were optimized by orthogonal design， and its structure was identified by spectroscopy and the content was detected by high performance liquid chromatography. The high performance liquid chromatography was performed on a ZORBAX SB-C18 chromatography column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） and with the detection wavelength at 220 nm. The mobile phase was water-acetonitrile-isopropyl alcohol （60∶35∶5）， flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 30℃. Results The optimum preparation conditions of ginkgolide K were as follows： the feed ratio was 1∶4.5， solvent ratio was 1∶30， reaction time was 20 min and reaction temperature was 4℃. The target compound was identified as ginkgolide K by Q-TOF-MS， 1H-NMR， 13C-NMR and two-dimensional NMR spectroscopy. Conclusion The preparation process is mild， the preparation cycle is short， the operation is simple， the yield is high， and it is suitable for industrial production.

[Key words] Ginkgolide; Ginkgolide K; Fluoride reagent; Structural identification

銀杏內酯K是一種強的天然血小板活化因子拮抗劑，能有效改善腦缺血再灌注造成的小鼠神經細胞的損傷，減少組織壞死，對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用[1-5]，它可以抑制H2O2、谷氨酸等誘導的細胞調亡，減輕受損細胞的氧化應激水平[6-7]，并有效改善內質網應激引起的細胞凋亡，治療心血管疾病[8]。銀杏內酯K 對血小板活化因子介導的中性粒白細胞葡萄糖酸苷酶釋放的抑制作用優于銀杏內酯B，對腦缺血再灌注急性期神經損傷中的保護作用優于銀杏內酯B以及白果內酯[9-12]。然而，銀杏葉中銀杏內酯K的含量極低，且分離困難，嚴重制約了該化合物的應用研究。

目前，尚無銀杏內酯K制備的研究報道。Bolshakov等[13]報道了銀杏內酯A、10-芐基-銀杏內酯C在二乙氨基三氟化硫存在的條件下，高選擇性地作用于其三級醇羥基，分別生成了銀杏內酯L和3，14-脫水-10-芐基-銀杏內酯C。根據上述報道可知，二乙氨基三氟化硫對銀杏內酯類化合物的三級醇羥基有較好的選擇性，對其中的二級醇羥基也有一定的作用。本研究以銀杏內酯B為原料，以投料比（銀杏內酯∶二乙氨基三氟化硫）、反應溶劑用量比（銀杏內酯∶二氯甲烷）、反應時間、反應溫度考察因素，采用正交試驗設計對銀杏內酯K的制備工藝進行優選，以期為其工業化生產和應用研究提供幫助。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS205DU電子天平（梅特勒-托利多，0.01/0.1 mg）、Bruker AM-400核磁共振儀（瑞士Bruker公司）、Q-TOF-LC-MS聯用儀、Agilent 1260型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]、N-1100旋轉蒸發儀-循環冷卻裝置[埃朗科技貿易（上海）有限公司]、SH05-3G恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦有限公司）、BCD-218冰箱（西門子）、LGJ-12型冷凍干燥機（北京松源華興有限公司）。

1.2 試藥

銀杏內酯B（批號：160501，純度：91.2%，購自臨沂愛康藥業有限公司）、銀杏內酯K（批號：111936-201502，純度：94.7%，購自中國食品藥品檢定研究院）。

二乙胺基三氟化硫[購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]，甲醇、異丙醇、二甲基亞砜為色譜純，二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 銀杏內酯K制備

取0.43 g銀杏內酯B（0.1 mol），加入裝有30 mL二氯甲烷的三口反應瓶中，置于冰水浴上攪拌溶解，同時緩慢加入60 μL（0.45 mol）二乙氨基三氟化硫，冰水浴中4℃保溫反應20 min后，加入冰水淬滅反應，充分攪拌反應液，分離水相。用乙酸乙酯萃取水相，乙酸乙酯相用無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮蒸出溶劑即得銀杏內酯K粗品。銀杏內酯K粗品用乙酸乙酯和乙醇的混合溶劑結晶48 h（結晶48 h后結晶物不再增加），得到白色結晶片狀固體，減壓干燥12 h，即得目標產物，稱重，計算收率。化學反應式見圖1。

2.2 銀杏內酯K含量測定

2.2.1 對照品溶液制備? 取銀杏內酯K對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.05 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備? 稱取銀杏內酯K樣品約5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.3 色譜條件與系統適用性試驗? 采用HPLC法測定銀杏內酯K的含量，參考相關研究[14-16]的方法并進行了優化。色譜條件為：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：水-甲醇-異丙醇（60∶35∶5）;柱溫：30℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：220 nm。理論塔板數以銀杏內酯K計不低于10 000。

2.2.4 銀杏內酯K測定方法? 照高效液相色譜法（《中國藥典》2015年版通則0512）測定。精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法計算銀杏內酯K的含量，即得。

2.3 正交實驗設計

在單因素試驗的基礎上，取銀杏內酯B原料9份，每份0.43 g，以銀杏內酯K的收率為評價指標，考察投料比（銀杏內酯∶二乙氨基三氟化硫）、反應溶劑用量比（銀杏內酯∶二氯甲烷）、反應時間和反應溫度，采用四因素三水平的L9（34）正交表優選銀杏內酯K的制備工藝。因素水平見表1，正交表及試驗結果見表2。

四個因素對銀杏內酯K的收率影響大小為：投料比>反應時間>溶劑用量比>反應溫度。最佳的工藝條件為投料比為1∶4.5，反應溶劑用量比為1∶30，反應時間為20 min，反應溫度為4℃。見表2。方差分析表明，各因素試驗水平對銀杏內酯K的收率均無顯著性影響。見表3。

2.4 驗證試驗

取銀杏內酯B原料3份，每份約10 g，根據正交試驗設計優選的最佳制備工藝條件進行3批驗證試驗。3批驗證試驗表明，銀杏內酯K的收率分別為75.10%、75.74%、75.29%，均值為75.38%，RSD為0.44%，表明該工藝穩定性良好。

2.5 結構確證

通過化學合成的方法制備、分離純化得到的化合物為白色片狀結晶（乙醇-乙酸乙酯），進一步用質譜及核磁共振譜分析其結構。TOF-MS-ES-（m/z）405.1167（計算值為405.1186）。見圖2。1H-NMR、13C-NMR數據（表4～5）與Weinges等[17]的研究報道一致。結合上述質譜、1H-NMR、13C-NMR以及二維核磁譜H-H COSY、HSQC、HMBC和NOESY的數據，確定該化合物為銀杏內酯K，分子式為C20H22O9。其結構見圖3。

3 討論

近年來，銀杏內酯K在腦血管疾病中的作用機制研究取得了新的進展，其作用機制可能與銀杏內酯A、B等化合物不同[18]，但還需要進一步研究。與銀杏內酯K制備有關的文獻報道較少。在某些條件下，銀杏內酯B的3-OH被活化，產生其衍生物銀杏內酯K，但其轉化率非常有限[19]。Zekri等[20]研究表明，銀杏內酯環結構的穩定性與其溶解介質的pH值密切相關，當pH=7時，其內酯環開始開環，在堿性條件下不穩定易開環，易造成副產物的增多。因此，在堿性條件下制備銀杏內酯K的方法產率低且副產物較多，不適合工業化生產。

本研究選用最常見的氟化試劑二乙氨基三氟化硫，其對銀杏內酯類化合物的三級醇羥基有較好的選擇性，且適當過量的二乙氨基三氟化硫更有利于反應。另外，這可能對其二級醇羥基也有一定的作用，但未分離到氟代的產物，與Bolshakov等[13]的研究報道基本一致。本研究采用正交試驗設計得到銀杏內酯K的最佳制備工藝條件，即投料比為1∶4.5，溶劑用量比為1∶30，反應時間20 min和反應溫度4℃。在此工藝條件下，制備、純化銀杏內酯K的收率大于75%。該制備工藝操作簡單、周期短、穩定性好，適合工業化生產。

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（收稿日期：2018-02-28? 本文編輯：王? ?蕾）