南極磷蝦蛋白粉的制備工藝

王凌云，鄧尚貴*，李鈺金，霍健聰，謝卓宣，徐燕娟

1(浙江海洋大學 食品與藥學學院，浙江 舟山，316000)2(山東泰祥食品股份有限公司，山東 榮成，264300)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)屬甲殼綱，為一種生活在南大洋海域的高等浮游甲殼動物。南極磷蝦營養價值高，但由于南極磷蝦體內自溶酶活性高，捕撈后極易自溶，鮮銷時需要完善的冷鏈保存。因此，開發南極磷蝦蛋白資源的新的利用途徑成為當務之急。

蛋白粉是目前深受消費者歡迎的營養保健品，南極磷蝦蛋白質含量高，脂肪含量低，且富含多種礦物質，屬優質動物蛋白資源，是生產蛋白粉的優質原料。目前，國內南極磷蝦蛋白的加工和利用研究剛剛起步[1-4]，關于南極磷蝦蛋白粉的研究報道基本處于一片空白。本研究小組采用木瓜蛋白酶對南極磷蝦進行酶解，制備南極磷蝦蛋白液，利用噴霧干燥制備南極磷蝦蛋白粉，并對蛋白粉進行營養評價，為這類資源的高值化開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

南極磷蝦(于2018年1日捕獲)，山東泰祥食品有限公司提供。冷凍南極磷蝦于2018年3月6日在冷凍條件下運至實驗室，于-60 ℃條件下貯存。

木瓜蛋白酶(2×105U/g)，購于廣西南寧龐博生物工程有限公司；化學試劑及分子質量標準品等均購于國藥集團上海化學試劑有限公司(分析純)。

液相色譜儀(安捷倫 1260)，美國安捷倫科技公司；氨基酸自動分析儀(L-8900)，天美科學儀器有限公司；原子吸收分光光度計(TAS-990)，北京普析通用儀器有限責任公司；色差儀(WF32)，上海化科實驗器材有限公司；紫外可見分光光度計(UV-2600)，上海皖寧精密科學儀器有限公司；噴霧干燥機(SD-1000)， 日本東京理化；旋轉蒸發儀(A-1000S)，日本東京理化；其余均為實驗室常用設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程

冷凍南極磷蝦→解凍→稱量→加水勻漿→恒溫酶解→滅酶(100 ℃，15 min)→

1.2.2 酶解條件單因素試驗[5]

南極磷蝦原料，南極磷蝦于實驗前一日從超低溫冰箱中取出，置于普通冰箱冷藏室內自然解凍，實驗前用濾紙吸干表面水分，采用食物攪拌機攪碎后制得南極磷蝦肉糜。南極磷蝦酶解用酶，考慮到木瓜蛋白酶資源豐富，價格低廉，且水解能力好等優點，本實驗選擇木瓜蛋白酶進行水解。取經攪碎后的南極磷蝦肉糜15 g置于燒杯中，加入適量蒸餾水，調節pH值，加入適當比例的木瓜蛋白酶，用水浴鍋升至合適溫度，并在此溫度下保溫酶解。酶解結束后升至100 ℃， 保溫15 min后滅酶，離心取上清液，進行超濾分離，測定蛋白酶水解度。具體酶解條件如下。

料液比：在加酶量為3 000 U/g，酶解溫度55 ℃， pH 6.5時，設料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在此條件下恒溫水浴2 h。

加酶量：在酶解溫度55 ℃，pH 6.5，料液比為1∶2 時，設加酶量分別為600、1 800、3 000、4 200、5 400 U/g， 在此條件下恒溫水浴2 h。

溫度：在加酶量為3 000 U/g，pH 6.5時，料液比為1∶2時，設水浴加熱溫度分別為45、50、55、60、65 ℃。 在此條件下恒溫水浴2 h。

pH值：在加酶量為3 000 U/g，酶解溫度55 ℃，料液比為1∶2時，設pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0， 在此條件下恒溫水浴2 h。

酶解時間：在加酶量為3 000 U/g，酶解溫度55 ℃， 料液比為1∶2時，pH值6.5時，設水浴加熱時間分別為0.5、1、2、4、6 h。

1.2.3 南極磷蝦水解度的測定[6]

待南極磷蝦酶解結束，將酶解液離心，取上清液并進行超濾，得到酶解液。用甲醛滴法測定上清液氨基酸含量，代入式(1)計算水解度(DH)。

(1)

1.2.4 酶解物分子質量排布測定

酶解物分子質量排布測定采用凝膠過濾色譜法。稱取一定量南極磷蝦酶解物用流動相溶解，在0.45 μm膜過濾后上柱記錄出峰時間，求其相對分子質量[7]。層析條件:色譜柱(TSK gel 2500 PWXL 300 mm×7.8 mm)，柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min，在波長220 nm下測定。

1.2.5 南極磷蝦蛋白粉噴霧干燥工藝[8]

首先將南極磷蝦酶解液在真空濃度為0.95 MPa，轉速5 000 r/min條件下進行真空濃縮。濃縮結束后的酶解液噴霧干燥，每次干燥處理料液量1 500 mL。

進料濃度：進風溫度180 ℃，進料溫度30 ℃，進料速度12 mL/min，出風溫度80 ℃條件下，分別選用進料液蛋白質量濃度為100、150、200、250 g/L的料液噴霧干燥。

進風溫度：在進料液蛋白質量濃度為250 g/L，進料溫度30 ℃，進料速度12 mL/min，出風溫度80 ℃條件下，分別選用160，170，180，190和200 ℃作為進風溫度。

進料速度：選用進風溫度180 ℃，進料液蛋白質量濃度250 g/L，進料溫度30 ℃，出風溫度80 ℃條件下，進料速度分別采用6，8，10，12和14 mL/min。

進料溫度：選用進風溫度180 ℃，進料液蛋白質量濃度250 g/L，進料速度12 mL/min，出風溫度80 ℃， 選取進料溫度分別30，40，50和60 ℃。

1.2.6 堆積密度及溶解度的測定

堆積密度測定[9]：將蛋白粉從漏斗中撒落至干燥的10 mL量筒(量筒質量記為m1)中，測定量筒和蛋白粉總質量(記為m2)，則堆積密度按式(2)計算。

(2)

溶解度測定參照GB5413.29—2010《嬰幼兒食品和乳品溶解性的測定》。

1.2.7 蛋白粉白度、濕潤性、分散性及流動性的測定

蛋白粉白度測定采用色差儀[10]；濕潤性、分散性及流動性測定參照王一等[11]的方法。

1.2.8 南極磷蝦蛋白粉營養成分分析

南極磷蝦蛋白粉蛋白質、脂肪等基本營養成分測定等參照李明杰的方法[12]。

1.2.9 數據分析

采用SPSS 17.0 軟件中線性回歸(linear regression)、單因素方差分析(one-way ANOVA)、多因素方差分析(univariate)進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦蛋白酶解工藝

圖1～圖5分別是加酶量、酶解溫度、pH值、酶解時間和料液比對水解度的影響。由圖1可知，酶用量越高，水解度越高，當酶用量為1 800～3 000 U/g蛋白時，水解度上升顯著。當酶用量繼續增加，水解度增加緩慢，差異不顯著。當酶用量為3 000～4 200 U/g時，水解度增幅逐漸減小，趨于平衡。故酶用量確定為3 000 U/g。酶解溫度對水解度的影響見圖2， 為明顯的峰狀曲線。當溫度為55 ℃時水解度最高，且與其他溫度條件存在顯著性差異，表明55 ℃為最適酶解溫度。pH對蛋白回收率的影響同溫度相似，同樣呈較為典型的峰狀曲線，當pH 6.5時水解度最高，且與其他pH值存在顯著差異，所以pH對酶解反應影響很大[13]。

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Influence of enzyme content on hydrolysis degree

由圖4可知，酶解時間越長，水解度越高，而酶解時間達2 h后，水解度差異不顯著。圖5表明隨著料液比增加，水解度呈逐漸下降趨勢。雖然當料液比為1∶1時，水解過程中會出現酶解不充分的現象。而當料液比為1∶2時，下降不多，且經實驗驗證，此時酶解反應比較充分。因此選擇料液比1∶2 作為酶解反應的濃度。實踐表明，食品蛋白的酶解改性具有安全可靠、作用溫和、專一性強、效率較高的特點[14-16]。

圖2 溫度對水解度的影響Fig.2 Influence of temperature on hydrolysis degree

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 Influence of pH on hydrolysis degree

圖4 酶解時間對水解度的影響Fig.4 Influence of time on hydrolysis degree

圖5 料液比對水解度的影響Fig.5 Influence of the material solution to hydrolysis degree

單因素試驗結果表明：酶用量3 000 U/g蛋白、酶解溫度55 ℃、pH 6.5、酶解時間2 h和料液比1∶2為最佳酶解條件。

2.2 南極磷蝦酶解產物分子質量排布

按照木瓜蛋白酶用量3 000 U/g蛋白、55 ℃、pH 6.5、酶解時間2 h、料液比1∶2的工藝條件酶解南極磷蝦，所得酶解液的相對分子質量見圖6。首先，根據標準蛋白質相對分子質量及其對應的出峰時間，求出相對分子質量標準曲線，再用南極磷蝦酶解物上柱，記錄出峰時間，從標準曲線即可求出南極磷蝦酶解產物的相對分子質量。由圖6可以看出南極磷蝦酶解液的分子質量多集中在3～10 kDa。通過前述實驗條件制備的南極磷蝦酶解產物中相對分子質量大多處于3～10 kDa，表明該水解條件較為理想。

圖6 南極磷蝦酶解產物分子質量排布Fig.6 Molecular weight distribution of Euphausia superba enzymolysis products

2.3 噴霧干燥工藝對南極磷蝦蛋白粉品質的影響

2.3.1 進料濃度對蛋白粉品質的影響

表1列出不同進料量對南極磷蝦蛋白粉的影響。進料濃度很大程度上影響噴霧干燥的效果，還影響著噴霧干燥生產的經濟成本。由表1可以看出，物料的進料濃度越大，蛋白粉水分含量越低。而蛋白粉的白度隨著進料濃度的加大而有所降低，白度的測定采用申光WSC-S測色色差計測量，這是因為當濃度達到一定數值時，液滴表面水分蒸發速度快，表層容易形成固殼，使得粉粒內部殘留部分水分，造成白度有所降低[17]。

當進料液蛋白質量濃度較高(200 g/L，250 g/L)時，蛋白粉的堆積密度比進料液蛋白質量濃度較低(100 g/L，150 g/L)時要高。這可能是由于進料濃度增大導致了料液在經霧化后的產品水分含量降低，更為干燥，因此堆積密度增大。而流動性和分散性則隨著進料濃度的升高有所降低。總體而言，進料濃度對白度、堆積密度等品質指標影響并不顯著。因此，應從干燥后水分含量低的高濃度進料濃度考慮。但當用大于250 g/L的進料濃度進行噴霧干燥時，料液變得過于黏稠。盡管采用磁力攪拌器攪拌，但霧化效果極差，霧化噴頭處極易出現油狀黏稠液滴。雖然所得蛋白粉水分含量及分散性的指標好，但從實際出發，選擇進料液蛋白濃度25%較為適宜。

表1 不同進料液蛋白質量濃度對南極磷蝦蛋白粉品質的影響Table 1 Effect of liquid concentration on protein powder quality

注：進風溫度180 ℃，進料溫度30 ℃，進料速度12 mL/min；同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3.2 進風溫度對蛋白質品質的影響

表2給出了進風溫度對南極磷蝦蛋白粉品質影響。由表2可以看出，干燥后的蛋白粉水分含量和進風溫度成反比。堆積密度測定方法為：用漏斗向量筒中均勻地撒落樣品，撒滿后稱量樣品的質量,計算堆積密度[18]。當進風溫度較低(160 ℃，170 ℃)，蛋白粉的白度，堆積密度，流動性和濕潤性等無明顯差異。此時由于含水量較高，噴霧干燥所得蛋白粉黏度較高，因此無法測量分散性?？傮w而言，進風溫度越高，蛋白粉品質有所升高，但當進風溫度超過190 ℃后，部分蛋白粉發生了高溫變性，導致蛋白粉附著于噴霧干燥管壁，以至于得率降低。最終確定噴霧干燥進風溫度為180 ℃。

表2 進溫度對南極磷蝦蛋白粉品質的影響Table 2 Effect of feeding temperature on protein powder quality

注：進料溫度30 ℃、進料速度12 mL/min，進料液蛋白質量濃度25%，“-”表示未能檢測，下同。同列不同字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

2.3.3 進料速度對蛋白質品質的影響

表3列出進料速度對南極磷蝦蛋白粉品質的影響。從表可以看出，蛋白粉的水分和白度隨著進料速度的增加而上升。這是由于物料經噴霧系統處理后變為小液滴，進料量越大，在造霧壓力一定的情況下，料液被霧化成霧滴的粒徑越大，由于慣性作用其速度也越大，其在干燥器內停留時間短，容易發生干燥不完全的現象，從而導致終產品含水率較高[19]。而進料速度和蛋白粉堆積密度成反比。

表3 進料速度對南極磷蝦蛋白粉品質的影響Table 3 Effect of feeding speed on protein powder quality

注：進風溫度180 ℃，進料濃度250 g/L，進料溫度30 ℃。同列不同字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

這可能由于進料速度加大后，霧化的小液滴量增加，在熱空氣量恒定的條件下，單位質量小液滴吸收熱量降低，導致干燥顆粒含水量增加，相互黏結趨勢增大，產生較大的堆積體積，堆積密度降低[20]。當進料速度為6 mL/min和8 mL/min時，流動性和分散性間差異不顯著(P>0.05)。當進料速度增大，流動性變化較大，然而進料速度大于12 mL/min后，水分含量過高，蛋白粉分散性變差。此外，不同進料速度組蛋白粉白度無顯著性差異。綜合考慮后確定進料速度保持在12 mL/min較為適宜。

2.3.4 進料溫度對蛋白粉品質的影響

表4為進料溫度對南極磷蝦蛋白粉的影響。由表4可知，隨著進料溫度的升高，水分含量下降，堆積密度上升，而分散性、流動性變好，進料溫度對白度影響不明顯。這可能是因為進料溫度升高后加快噴霧液滴的干燥，提高干燥效率，干燥更為徹底。由表4可知，進料溫度30 ℃和60 ℃的物料干燥后所得產物水分含量均低于5%，達到GB 11674—2010《食品安全國家標準乳清粉和乳清蛋白粉》要求。從生產實際出發，選擇30 ℃更為方便，確定30 ℃為進料溫度。

按各單因素試驗確定的最佳工藝參數進行組合試驗后，得到的蛋白粉品質如表5所示。蛋白粉外觀呈白色粉狀，顆粒較細，吸濕性較強。

表4 進料溫度對南極磷蝦蛋白粉品質的影響Table 4 Effect of feeding temperature on protein powder quality

注：進風溫度180 ℃，進料液蛋白質量濃度250 g/L，進料速度12 mL/min。同列不同字母表示在P= 0.05水平上差異顯著。

表5 南極磷蝦蛋白粉噴霧干燥組合試驗結果Table 5 Combination test results of Antarctic krill protein powder spray drying

2.4 南極磷蝦蛋白粉品質分析

按照工藝參數：進料液蛋白質量濃度250 g/L、進風溫度180 ℃、進料速度12 mL/min制備的南極磷蝦蛋白粉基本營養成分等指標見表6。南極磷蝦蛋白粉中脂肪含量顯著降低，僅為8.3 mg/L，且含有Fe、Na等礦物元素。

表7是南極磷蝦蛋白粉氨基酸成分和河蚌蛋白粉比較。由表7可以看出，南極磷蝦蛋白粉中氨基酸總含量要明顯高于河蚌蛋白粉。其中，河蚌蛋白粉中呈鮮、呈甜的氨基酸(天門冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和丙氨酸)占總氨基酸的 22.7%[21]。

表6 南極磷蝦蛋白粉主要成分Table 6 The main components of Antarctic krill protein powder

南極磷蝦蛋白粉中呈鮮、甜味的氨基酸占氨基酸總量的45.4%，南極磷蝦蛋白粉中谷氨酸占總氨基酸含量比例最高，為14.57%。此外，南極磷蝦蛋白粉中必需氨基酸占總氨基酸的38.85%，這項結果表明南極磷蝦蛋白粉是生產海鮮調味品的優質原料，且在人類保健方面具有極高的開發利用前景。

表7 南極磷蝦蛋白粉氨基酸組成分析 單位：g/100g

3 結論

(1)采用木瓜蛋白酶對南極磷蝦進行酶解制備南極磷蝦蛋白粉，最佳酶解參數：每100 g南極磷蝦肉糜中木瓜蛋白酶用量3 000 U/g蛋白、酶解溫度55 ℃、 酶解pH 6.5、酶解時間2 h、料液比1∶2。按上述工藝制備的南極磷蝦酶解液水解產物相對分子質量多為3 000～5 000 Da。

(2)南極磷蝦酶解液噴霧干燥最佳工藝參數：進料液蛋白質量濃度250 g/L、進風溫度180 ℃、進料溫度30 ℃、 進料速度12 mL/min。由該工藝參數制備的南極磷蝦蛋白粉各特性指標較好，呈白色粉狀吸濕性較強。

(3)按最佳工藝制備的南極磷蝦蛋白粉是具蝦香味的干燥粉末，其主要成分為：氨基態氮 2.87%，多糖 4.7%，脂肪 0.83%，灰分為 23.19%。