一株鏈霉菌的鑒定及其產bafilomycin A1的發酵工藝研究

周劍,方志鍇,孫菲,江紅

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州，350007)

Bafliomycins是一類由放線菌發酵產生的含有16元環骨架的多烯大環內脂類抗生素，化學結構極為特殊，大部分衍生物的側鏈結構中都含有1個六元環的半縮醛結構[1]。其結構類似物有bafilomycin A1，A2，B1，B2，C1，C2，D,E,F～J等[2]。其中bafilomycin A1是一種空泡H+-ATP酶(vacuolar-type H+-ATPase,V-ATPase)的特異性抑制劑，能夠抑制自噬體和溶酶體結合而抑制自噬[3-4]。V-ATPase廣泛分布于真核生物的液泡，反式高爾基體，溶酶體，核內體，分泌顆粒等細胞內膜系統中，根據細胞器官的微小酸性差別，各自發揮獨立機能，是一種新的藥物靶點[5-7]。

目前已報道的bafliomycins產量都不高，WERNER等[8]從100 L灰色鏈霉菌的發酵產物中分離得到bafliomycins A1 45 mg、A2 36 mg、C1 120 mg，YU等[9]從菌株YIM56209的9.6 L發酵產物分離得到bafliomycins C1 1.8 mg。CARR等[10]從海洋來源的放線菌分離到bafilomycin F，其生物產量也極低。LEE等[11]報道發酵過程添加80 mmoL纈氨酸可以使bafilomycins產量達到 35 mg/L。國內魏剛等[2]報道從海洋放線菌Y12-26中分離得到bafilomycin A1，且產量極低。潘華奇等[12]報道卡伍爾鏈霉菌經發酵產生的bafilomycin B1和bafilomycin C1含量分別達23.45 mg/L和6.603 mg/L。楊巍民等[13]報道海洋放線菌Y-0117在40 L發酵液得到bafilomycin D純品約0117A(14.7 mg)。 由于微生物發酵生產bafliomycins產量的低下，其應用受到極大的限制。目前已有學者對bafliomycins的生物合成途徑進行研究[14-17]，但是關于菌種誘變、發酵代謝調控方面研究較少。

本課題組致力于從微生物代謝產物中篩選抗腫瘤化合物。前期從一株鏈霉菌FIM-B0711發酵液中發現了具有抗腫瘤活性的組分。對FIM-B0711發酵液中的有效成分進一步分離純化得到化合物BAF0711-A，經波譜方法鑒定，化合物BAF0711-A為大環內脂類抗生素bafilomycin A1[18]。由于原始菌株發酵水平比較低，本文先后利用單因素實驗、正交試驗設計等對放線菌FIM-B0711的發酵培養條件及發酵工藝進行優化，旨在提高bafilomycin A1的產量，為后續擴大培養提供合適的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

S30K型pH儀,瑞士梅特勒公司；INNOVA-5000型雙層搖床，New Brunswick Scientific公司；Agilent 1260 DAD高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.2 實驗菌株

菌種鏈霉菌FIM-B0711，由本研究室篩選保藏。

1.3 培養基

斜面培養基：ISP2；分離平板培養基：ISP2；種子培養基(g/L)：麥芽浸粉20，蛋白胨20，CaCO310(pH為7.2)；發酵培養基(g/L)：麥芽浸粉20，蛋白胨20，CaCO310(pH為7.2)。

1.4 培養方法

斜面28 ℃培養10～12 d待孢子生長成熟以后，刮取新鮮孢子接于種子培養基，置于28 ℃培養，搖床轉速為220 r/min，培養48 h左右；按接種量5.0%接種到發酵培養基，后置于28 ℃，搖床轉速220 r/min，振蕩培養120 h。

1.5 鏈霉菌FIM-B0711的鑒定

(1)形態學觀察：平皿插片法[19]。

(2)培養特征與生理生化特征，采用國際鏈霉菌計劃(ISP)以及參照《鏈霉菌鑒定手冊》中推薦的培養基，于28 ℃培養10～20 d后觀察記錄菌株培養特征和生理生化特性[20]。

(3)16S rDNA基因序列分析，用溶菌酶法從新鮮菌體提取基因組DNA，采用通用引物(27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,1492R: 5’-CCTTA-CCTTGTTACGACTT-3’)進行16SrDNA擴增(94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環30次；72 ℃總延伸10 min)。擴增產物用凝膠回收試劑盒進行回收，測序。所測的16S rDNA序列經校對、拼接后與GenBank數據庫中相關種屬的序列進行BLAST比較。采用Mega 4.0 軟件菌株進行系統發育分析，利用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.6 分析方法

1.6.1 Bafilomycin A1產量測定

采用Agilent高效液相色譜HPLC-1200系列，色譜柱，Syncronis C18分析柱(4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm)，流動相：V(甲醇)∶V(水)=85∶15(等度洗脫)，進樣量：20 μL，流速：1.0 mL/min，洗脫時間：30 min，檢測波長：248 nm，柱溫：40 ℃。

樣品制備：發酵液加入2倍體積無水乙醇，混勻、振蕩20 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液即為測定液。

標準曲線的繪制：準確稱取bafilomycin A1標準品12.00 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配成質量濃度為1 200 μg/mL的標準品溶液，采用2倍稀釋法精確吸取該標準品溶液，用甲醇稀釋成18.75、37.5、75、150、300、600 μg/mL的系列溶液，分別取10 μL注入HPLC儀，以質量濃度(φ，μg/mL)為橫坐標，峰面積積分值(A)為縱坐標，線性回歸方程為：y= 30 013x+53 907，R2=1。根據公式(1)計算樣品產量。

(1)

1.6.2 菌絲濃度PMV的測定

取發酵液10 mL于10 mL刻度試管中，離心沉淀(5 000 r/min，15 min)，記錄沉淀物體積，mL。根據公式(2)計算菌絲濃度。

(2)

1.7 培養基與培養條件優化

1.7.1 單因素試驗

采用單因素試驗考察發酵培養基的組成如碳源、氮源、無機鹽(微量元素)、培養條件等對發酵產量的影響。

1.7.2 正交實驗設計

采用單因素實驗中確認對發酵產量影響較大的碳源、氮源成分做為正交試驗的因素進行考察。水平的設定主要從常用量出發，并在盡可能大的范圍內波動。以目標產物的產量為指標，按表1進行實驗，每組平行實驗3組，結果取平均值。實驗數據采用正交設計助手Ⅱ V3.1專業版進行分析。

表1 正交實驗設計因素水平表L9(34) 單位：g/L

1.7.3 搖瓶發酵過程的影響因素考察

采用單因素實驗法考察發酵培養條件對產量的影響，主要從以下方面考察：接種量(1.0%、2.5%、5.0%、 7.5%、10.0%)、發酵周期(24、36、48、60、72、84、96、108、120 h)、搖瓶裝量(60、80、100、120 mL)、 發酵溫度(26、28、30、32、34 ℃)、搖床轉速(120、140、160、180、200、220、240 r/min)、培養基原始pH值(5.5、 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)等進行。實驗數據采用Excel軟件進行作圖分析，取標準誤差(SD)作為誤差線。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 形態學觀察

鏈霉菌FIM-B0711革蘭氏染色為陽性，在高氏合成一號瓊脂和ISP2等培養基上生長7 d后，基內菌絲發育良好，無橫隔，不斷裂。氣生菌絲生長良好，多分枝，孢子絲直或柔曲。

2.1.2 培養特征

采用ISPl、ISP2、ISP3、ISP4等7種培養基，30 ℃培養14 d后，觀察菌絲體的顏色及色素情況。結果見表2。

表2 FIM-B0711培養特征Table 2 Cultural characteristics of strain FIM-B0711

注： “+ + +”表示好; “+ +”表示中等; “+”表示差。

2.1.3 生理生化特征

生理生化性質采用鏈霉菌分類中的標準方法。菌株FIM-B0711的生理生化反應為：明膠液化，深褐色素。牛奶凝固并胨化，淀粉水解好。纖維素上生長不良，硝酸鹽還原，產生類黑色素和H2S。利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-甘露醇、肌醇，不利用L-阿拉伯糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖。

2.1.4 16S rDNA基因序列分析

根據菌株的形態特征、培養特征、生理生化特征及16S rDNA序列綜合分析(圖1)，將菌株FIM-B0711鑒定為灰褐色鏈霉菌(Streptomycesgriseobrunneus)。

圖1 FIM-B0711基于16S rDNA構建的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree derived from 16S rRNA sequence of strain FIM-B0711

目前已有文獻報道產生巴弗洛霉素類化合物的微生物菌株主要有：卡伍爾氏鏈霉菌(Streptomycescavourensis)[12]、黃三素鏈霉菌(Streptomycesflavotricini)[13]、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)[11]、海洋放線菌(Streptomycessp.)[10]、海洋鏈霉菌(Streptomyceslohii)[14]以及白色鏈霉菌(Streptomycesalbolongus)[21]等。經對比菌株FIM-B0711與以上菌株都不同，是一株新的巴弗洛霉素產生菌。

2.2 搖瓶發酵培養基的考察

2.2.1 單因素考察碳氮源對bafilomycin A1發酵產量的影響

采用單一因素試驗考察碳氮源對發酵產量的影響，以WERNER配方為初始培養基[6]，培養基按照20 g/L 碳源，20 g/L氮源配比。其中考察了實驗室常用的12種碳源：葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、甘油、可溶性淀粉、糊精、麥芽糊精、馬鈴薯糊精、馬鈴薯淀粉，以及實驗室常用的12種有機氮源：玉米蛋白、玉米漿、黃豆粉、黃豆餅粉(熱軋)、黃豆餅粉(冷軋)、大豆蛋白胨、土豆蛋白、蠶蛹粉、酵母粉、魚胨、牛肉膏、棉籽粉，均以初始培養基作為對照。

由圖2碳源試驗結果可見，使用可溶性淀粉作為碳源產量提高較明顯，可以選用可溶性淀粉作為下一步優化實驗的碳源。

圖2 不同碳源的發酵水平的比較Fig.2 Comparison of different carbon sources used for Bafilomycin A1 production

由圖3氮源試驗結果可見，以酵母粉、玉米漿為氮源時發酵產量較高，而對照培養基為蛋白胨，考慮到菌株對復合氮源的需求，故選用酵母粉、玉米漿和蛋白胨作為候選氮源進行下一步試驗。

圖3 不同氮源的發酵水平的比較Fig.3 Comparison of different nitrogen sources used for bafilomycin A1 production

2.2.2 無機鹽對bafilomycin A1發酵產量的影響

主要考察選擇實驗室中常用的無機鹽和金屬離子對發酵產物的影響，一價金屬離子的添加量為2 g/L(主要有(NH4)2SO4、NaCl、K2SO4、KH2PO4、K2HPO4、NaNO3)，二價金屬離子的無機鹽添加0.5 g/L(主要有MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4、CaCl2)；對照培養基為含2 g/L CaCO3。

結果如圖4所示，添加無機鹽和金屬離子并不能提高產量，培養基中只需添加2 g/L的CaCO3即可，這樣也簡便了培養基配方。

圖4 無機鹽對bafilomycin A1發酵產量的影響Fig.4 Effect of inorganic salt on bafilomycin A1 production

2.2.3 正交試驗設計考察碳氮源組合對發酵產量的影響

以單因素優化篩選出的比較好的碳源(可溶性淀粉)、氮源(酵母粉、玉米漿和蛋白胨)做4因素3水平正交實驗(表3)。其他發酵因素無機鹽、發酵條件等都保持一致，重復3次。以發酵終點時bafilomycin A1的發酵產量為指標，來確定最優的碳氮源配方比例。

表3 正交實驗設計方案及結果Table 3 Orthogonal experiment design and results

從表3極差R值可以看出，影響bafilomycin A1發酵產量的4個因素的主次順序為可溶性淀粉>玉米漿>酵母粉>蛋白胨，可溶性淀粉含量因素對其合成影響最為顯著，是最關鍵的因子，其次是玉米漿。綜上，發酵培養基碳氮源的最佳培養基配方為(g/L)： 可溶性淀粉40、蛋白胨30、酵母粉20、玉米漿15、CaCO32。

2.3 搖瓶發酵過程環境因素的影響

發酵培養過程中環境因素對次級代謝產物的生成影響較大。這些因素包括：接種量、發酵時間、搖瓶裝液量、發酵溫度、搖床轉速、培養基初始pH值(圖5)。

可以得出，最適的培養條件為：接種量5.0%，發酵周期96 h，500 mL搖瓶裝液量100 mL，培養溫度28 ℃， 搖床轉速220 r/min，培養基初始pH值為7.0。

圖5 不同發酵條件對bafilomycin A1的發酵產量的影響Fig.5 Comparison of different fermentation conditions on bafilomycin A1 production

2.4 優化后發酵工藝的驗證

在綜合最優條件下，對鏈霉菌FIM-B0711在搖瓶水平進行5批發酵驗證試驗，結果顯示在最佳培養基配方和優化培養條件下，HPLC檢測圖譜如圖6、圖7所示，發酵液相對產量分別為447.9%、453.3%、432.1%、425.8%和462.1%，平均相對產量444.24%，發酵水平提高了344%以上。

圖6 發酵工藝優化前的bafilomycin A1 HPLC圖譜Fig.6 HPLC profiles of bafilomycin A1 produced by strain FIM-B0711 cultivated under original conditions mAU

圖7 發酵工藝優化后的bafilomycin A1 HPLC圖譜Fig.7 HPLC profiles of bafilomycin A1 produced by strain FIM-B0711 cultivated under optimized conditions

3 結論

本論文對實驗室篩選獲得的抗腫瘤海洋鏈霉菌FIM-B0711進行菌種鑒定，經對比FIM-B0711與目前已有文獻報道巴弗洛霉素類化合物的產生菌(Streptomycescavourensis、Streptomycesflavotricini、Streptomycesgriseus、Streptomyceslohii、Streptomycesalbolongus等)都不同，是一株新來源的巴弗洛霉素產生菌，經鑒定為灰褐色鏈霉菌(Streptomycesgriseobrunneus)。并在搖瓶水平進行發酵工藝初步研究。首先針對其發酵培養基進行了優化，在利用單因素試驗篩選合適的碳氮源種類的基礎上，應用正交實驗的設計方法，進一步明確了發酵培養基有關成分，確定了各因素的最優勢的配方組合。其次從發酵周期、裝液量、轉速、接種量、消泡劑等方面，對搖瓶的發酵工藝進行了初步優化。

發酵較適配方(g/L)：可溶性淀粉40、蛋白胨30、酵母粉20、玉米漿15、CaCO32。最適的培養條件為：接種量5.0%，發酵周期96 h，500 mL搖瓶裝液量100 mL，培養溫度28 ℃，搖床轉速220 r/min，培養基初始pH值為7.0。對比優化后的工藝較原始工藝發酵液中bafilomycin A1的產量提高了約344%，為規模化發酵奠定了基礎。