麻風康復者外周血Treg細胞及IL-10水平檢測

丘文苑 林 笛 林悅芹 謝彩霞 藍菲瑩 謝龍鳳 羅 權 張錫寶

麻風在組織學上以肉芽腫為特征，其反映著機體的免疫狀態。在麻風患者中同時存在細胞免疫和體液免疫，但以細胞免疫為主[1,2]。CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞屬于T淋巴細胞亞群，也叫抑制性T淋巴細胞，通過分泌具有下調作用的細胞因子發揮免疫調節、免疫耐受、免疫抑制作用。而IL-10在Treg細胞的分化及功能方面起著作用。目前，已有研究表明在麻風患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及血清IL-10比正常人明顯增多[3,4]。但對麻風愈合的免疫狀況研究卻很少，我們通過檢測麻風康復者外周血清中Treg細胞、IL-10，探討Treg細胞、IL10在麻風康復者體內的免疫狀況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本組患者為廣東省泗安醫院住院部休養員，共25例，其中男17例，女8例，年齡61～88歲，平均73.45歲，臨床上均治愈。并選取同年齡層的健康志愿者20名為對照組，要求血清學及肝腎功能檢查正常，排除感染結核、麻風、HBV、HCV、腫瘤及患自身免疫系統疾病的人群。

1.2 實驗試劑與儀器 IL-10檢測試劑盒(深圳達科)、RT-6000酶標分析儀、PerCP-抗人CD4 抗體、FITC-抗人CD25 抗體、PE-抗人Foxp3抗體、同型對照FITC-鼠IgG1、PE-鼠IgG1、人Foxp3 BufferSet、緩沖液Stain Buffer(FBS)(美國Becton-Dickinson公司)、流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

1.3 實驗準備 抽取每個實驗者及對照組患者各2管5 mL肝素抗凝血。分離出其中1管的外周血單個核細胞，細胞濃度調至2×107個/mL。分為空白管、CD25同型對照管、CD4CD25管、Foxp3同型對照管、CD4CD25Foxp3管，在各管中加入100 μL細胞懸液。①分別在各管中加入CD4、CD25抗體，空白管不加抗體，充分混勻，4℃避光孵育30 min；②各管加入染色劑2 mL,1500 r/min離心5 min，重復洗滌2次，棄上清液；③各管加入穿膜劑1 mL,4℃避光孵育30 min,再加入穿膜緩釋劑2 mL,1200 r/min離心5 min，重復洗滌2次，棄上清液；④在空白管中、CD25同型對照管、CD4CD25管中加入染色緩沖劑，充分混勻，避光待測;⑤Foxp3同型對照管、CD4CD25Foxp3管加入Foxp3抗體，混勻，4℃避光孵育30 min。再加入穿膜劑1 mL,4℃避光孵育30 min,；加入穿膜緩釋劑2 mL,1200 r/min離心5 min，重復洗滌2次，棄上清液。最后加入染色緩沖劑;⑥將各管全部拿出上流式細胞儀檢測。

1.4 Treg細胞檢測 按照流式細胞儀檢測方法，先上空白管，調節電壓，并以CD25同型對照調節補償，確定CD4+CD25+細胞群，再以CD4+CD25+細胞設門，以Foxp3同型對照確定其陽性信號，最后測定CD4CD25Foxp3管，檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+CD25+Treg細胞百分含量。

1.5 IL-10檢測 采用Elisa法，按試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 CD4+CD25+Foxp3+Treg檢測結果 利用流式細胞儀上的Cellquest軟件對各組進行分析。見圖1、2。麻風康復者組的CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+CD25+Treg細胞百分含量明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

圖1 麻風康復組CD4+CD25+Foxp3+Treg含量圖2 正常組CD4+CD25+Foxp3+Treg含量

2.2 兩組IL-10水平 麻風康復者組的外周血中IL-10明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

2.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平相關性分析 麻風康復的CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平呈正相關性(r=0.561，P<0.05)；正常對照組中的CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10水平呈正相關性(r=0.422，P<0.05)。

表1 各組CD4+CD25+Foxp3+Treg百分含量及血清IL-10含量

3 討論

麻風是由麻風分枝桿菌感染所致的一種傳染病，與機體免疫功能有關。在接觸相同數量的麻風桿菌，只有少數人發病。說明患者中存在不同程度的細胞免疫缺陷，而這些細胞免疫機制尚不明確。研究表明不同Th細胞亞群及其分泌的細胞因子功能紊亂在麻風發病發展中起著重要作用，免疫狀態失衡可導致麻風患者促發和加劇病情變化。

CD4+CD25+Foxp3+Treg調節性T細胞是一種具有免疫調節功能的T淋巴細胞，進入組織中會抑制自身免疫細胞，使機體形成一種免疫耐受，在一定程度上減少了自身免疫性疾病的發生，但也相應地減弱了機體對抗感染性病原菌。CD4+CD25+T淋巴細胞升高,意味著麻風康復者的抗感染能力減弱。

IL-10是一種抑制性炎癥因子，主要是由Th2細胞、巨噬細胞、單核細胞及基質細胞等分泌，其主要功能是抑制Th1細胞，是抗炎癥的重要細胞因子。在天然免疫中，IL-10通過抑制各種細胞(如巨噬細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞等)的分化、炎癥因子釋放來達到免疫抑制；而在獲得性免疫中，IL-10通過抑制CD4+T淋巴細胞的增殖、細胞因子生成[5]。所以當IL-10水平升高，表明機體的抑制Th1細胞的功能增強，機體容易受到外來細菌、病毒、真菌等感染，從IL-10的來源說，IL-10可以有多種細胞分泌，但主要由Th輔助T細胞分泌。

Foxp3+是CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的抑制因子的啟動子，可通過抑制因子的表達來發揮抑制作用，或通過抑制轉錄因子活性，從而負向調節細胞因子的表達。CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞表面存在能夠表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原，對效應性細胞起抑制作用；或通過細胞直接接觸機制或分泌IL-10等抑制細胞因子來抑制機體的免疫細胞的分化，對機體的免疫耐受和免疫應答具有重要作用[6]。過去的研究指出，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在麻風患者中明顯高于健康對照組，提示CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞可能在麻風疾病的進程中參與重要的作用[7]。外周血IL-10水平雖不能完全作為Treg細胞的定量分析，但可作為Treg細胞定量分析重要輔助指標。Treg 細胞可分泌IL-10,而IL-10可促進Treg細胞分化。本研究結果中麻風康復組的CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+CD25+Treg數值均明顯高于對照組(P<0.01)，同樣外周血的IL-10水平也顯著高于對照組(P<0.01)，能夠側面提示麻風康復者的免疫功能是有所下降的。Foxp3陽性的CD4+CD25+Treg細胞是機體具有負性免疫調節作用的T細胞亞群，臨床檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg調節性T細胞及IL-10水平對機體免疫功能的測定有一定意義。