抑制組織蛋白酶B表達對骨肉瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

孫堅皓，孫建廣，黃世磊，馬招鑫，皮國富

鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州450052

組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)是一種與木瓜蛋白酶結構相似的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，其在腫瘤生長、侵襲、轉移和血管生成中發揮重要作用[1-3]，并在多種腫瘤細胞(如胃癌[4]、肺癌[5]、結直腸癌[6]、食管癌[7]及前列腺癌[8])中呈現高表達，參與腫瘤的侵襲轉移過程；有研究[9]表明CB在骨肉瘤細胞中也呈現高表達。本實驗運用小干擾RNA(siRNA)特異性下調骨肉瘤細胞MG63中CB的表達，觀察其對骨肉瘤MG63細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料人骨肉瘤MG63細胞購自中國科學院上海生物化學與細胞生物研究所，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，鼠抗人CB單克隆抗體和兔抗人α-tubulin單克隆抗體購自美國Abcam公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，8.0 μm孔徑Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。陰性對照siRNA(NC-siRNA)、靶向CB基因的siRNA序列1～3(CB-siRNA1～3)由廣州銳博有限公司設計合成。

1.2細胞分組、培養及轉染將人骨肉瘤MG63細胞分成空白對照組、siRNA-1組(轉染CB-siRNA-1)、siRNA-2組(轉染CB-siRNA-2)、siRNA-3組(轉染CB-siRNA-3)和NC組(轉染NC-siRNA)5組。取處于對數生長期的各組細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，均在含有體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中于37 ℃、體積分數5%CO2、相對飽和濕度為95%的培養箱中培養，當細胞密度達60%～70%時按siRNA轉染說明書進行相應的轉染。每組均設6個復孔。

1.3各組細胞中CB蛋白表達的Westernblot檢測細胞轉染48 h后，提取細胞總蛋白，采用BCA法(按試劑盒說明書步驟進行)測定蛋白濃度后煮沸變性，按照試劑盒說明制備SDS-PAGE凝膠并進行電泳，電泳結束后將蛋白轉至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液室溫封閉1 h，加入鼠抗人CB單克隆抗體(按1∶1 200稀釋)、兔抗人α-tubulin單克隆抗體(按1∶2 000稀釋)4 ℃環境下過夜孵育，TBST洗3遍，5 min/次。加入HRP標記的二抗(分別按1∶2 000、1∶5 000稀釋)孵育1 h。TBST洗3遍，5 min/次。于暗室內用化學發光ECL顯影液顯示蛋白條帶。應用Image J軟件計算各蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.4各組細胞增殖活力的檢測采用CCK-8法，將處于對數生長期的細胞分為空白對照組和siRNA-2組接種于96孔板，每組設6個復孔，6×103個/孔。分組轉染后，分別在0、24、48、72和96 h后換液，并加入CCK-8試劑，繼續在培養箱中孵育2 h，用酶標儀測定450 nm波長吸光度值。

1.5各組細胞的克隆形成實驗將處于對數生長期的細胞分為空白對照組、siRNA-2組、NC組3組，給予相應處理，每組設6個復孔。10 d后用40 g/L的多聚甲醛固定20 min，1.25 g/L結晶紫甲醇溶液染色2 min，PBS清洗殘留染色液后拍照，并計算細胞數>50個的克隆數。實驗重復3次。

1.6各組細胞劃痕愈合實驗在6孔板板底用記號筆水平劃5條互相平行的定位線。將處于對數生長期的細胞分為空白對照組、siRNA-2組、NC組3組接種于該6孔板，每孔2×105個細胞，給予相應處理。培養至細胞密度為90%～100%時，用200 μL移液槍槍頭于每孔中線垂直于定位線做劃痕，然后每孔加2 mL無血清培養基繼續培養細胞。于劃痕后0、6和12 h在倒置顯微鏡下定點拍照，然后用Image J軟件分別計算0、6、12 h后的劃痕面積。用[0 h劃痕面積分別-6(或12 h)劃痕面積]/0 h劃痕面積×100%計算劃痕愈合率。實驗重復3次。

1.7各組體外侵襲實驗將Matrigel膠用DMEM培養基按1∶8稀釋，每個小室加入稀釋液50 μL，在37 ℃培養箱內恒溫放置30 min。取空白對照組、siRNA-2組、NC組轉染后72 h的細胞，常規胰蛋白酶消化后計數，調整細胞密度為5×105個/L，每孔取100 μL細胞懸液接種于上室，下室每孔加入500 μL含體積分數20%胎牛血清培養基，培養48 h后取出小室，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，1.25 g/L結晶紫甲醇溶液染色2 min，棉簽拭去上室面細胞，PBS清洗殘留染色液，100倍倒置顯微鏡下每孔選取上、下、左、右、中5個視野拍照并計數。實驗重復3次。

1.8統計學處理采用SPSS 23.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組MG63細胞中CB蛋白表達、細胞增殖能力、細胞克隆形成能力、細胞劃痕愈合率和細胞侵襲能力的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組MG63細胞中CB蛋白的表達比較見圖1。由圖1可知，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組CB蛋白相對表達量分別為(0.498±0.012)、(0.198±0.025)和(0.625±0.006)，空白對照組及NC組分別為(2.004±0.013)和(1.596±0.057)，各組間比較差異有統計學意義(F=441.768，P<0.001)，其中siRNA-2組CB蛋白相對表達量最低，故將siRNA-2用于后續實驗。

2.2各組MG63細胞增殖能力的比較見表1。

2.3各組MG63細胞克隆形成實驗結果siRNA-2組細胞克隆形成數(74.3±4.5)明顯低于空白對照組及NC組[(103.0±10.1)和(109.7±14.6)]，差異有統計學意義(F=9.450，P<0.001)。

1：NC組；2：siRNA-3組；3：siRNA-2組；4：siRNA-1組；5：空白對照組

圖1 各組MG63細胞中CB蛋白的表達

2.4各組MG63細胞劃痕愈合實驗結果見表2。

表2 各組MG63細胞劃痕愈合率 %

*：與其他兩組比較，P<0.05

2.5各組MG63細胞體外侵襲實驗結果見圖2。siRNA-2組細胞侵襲數(48.6±9.5)與空白對照組(93.6±12.1)及NC組(102.4±21.1)相比差異有統計學意義(F=34.677，P<0.001)。

A：空白對照組；B：siRNA-2組；C：NC組

3 討論

目前對骨肉瘤發病、轉移及復發的分子機制研究尚未完善，蛋白質的異常表達是惡性轉化的重要特征。組織蛋白酶家族在多種腫瘤組織中特異性高表達；組織蛋白酶D(CD)被認為是潛在的目標蛋白，CD在骨肉瘤肺轉移和化療耐藥中的表達增加表明CD在OS的病理過程中具有重要作用[10]，同時CD可以激活CB[11]；降低骨肉瘤細胞組織蛋白酶K(CK)的表達后可顯著降低其增殖、侵襲能力[12]。以上可以看出組織蛋白酶家族在腫瘤的發生發展中發揮著重要作用。

RNA干擾(RNAi)是雙鏈核糖核酸(dsRNA)特異性調節基因活性的天然過程，它以特異性沉默靶基因表達為特征，在疾病治療中具有很大的潛在應用價值[13-14]。本實驗運用脂質體將合成的CB-siRNA轉染入MG63細胞中，實驗結果顯示，與空白對照組和NC組相比，CB-siRNA轉染組CB表達量下降，說明CB-siRNA能特異且有效地抑制CB的表達。后續實驗結果表明，抑制CB表達后MG63細胞增殖能力明顯減弱，證明CB可促進骨肉瘤細胞的增殖。有研究[15]表明，抑制CB后子宮內膜癌細胞的增殖能力也減弱，與本文結果相一致。腫瘤細胞的遷移能力是轉移至繼發部位所必需的，本實驗細胞劃痕實驗結果表明抑制CB表達后，MG63細胞的遷移能力明顯減弱，說明CB對骨肉瘤細胞的遷移起積極作用。有研究[16]報道，在前列腺癌中降低CB表達后細胞遷移能力也降低，與本實驗結果相一致。腫瘤的侵襲是其發生遠處轉移的關鍵步驟，研究[17]表明，腫瘤的侵襲發生在低pH區域，酸性胞外環境能夠誘導溶酶體迅速轉移至細胞外周，導致溶酶體胞吐增加，分泌大量的CB，CB作用于基膜，促使基膜蛋白Ⅳ型膠原的降解增加，從而促進腫瘤的侵襲及轉移。本研究中Transwell實驗結果顯示，下調CB表達后MG63細胞的穿膜數明顯減少，說明沉默CB后MG63細胞的侵襲能力明顯降低，也證明了CB參與骨肉瘤的侵襲過程。有研究表明，下調一些腫瘤細胞(子宮內膜癌[15]、前列腺癌[16]、乳腺癌[18])CB表達后，其細胞侵襲能力亦明顯降低，與本研究結果一致。以上結果證明，CB可以促進骨肉瘤細胞的惡性行為，參與骨肉瘤的增殖、遷移及侵襲過程，因此CB有望成為骨肉瘤基因治療的有效靶點。

綜上所述，CB參與了骨肉瘤的惡性進展，有可能成為治療骨肉瘤的潛在靶點。但是，該研究也存在不足之處，如僅從細胞學方面證明了CB在骨肉瘤中的作用，因此，下一階段作者將進行體內實驗進一步驗證本實驗結論。