轉染miRNA-145、黏結合蛋白多糖-2 siRNA對膀胱癌T24細胞增殖、分化的影響

李雨晴,劉紅春,朱 峰)

1)河南中醫藥大學第二臨床學院檢驗科 鄭州 450046 2)鄭州大學第一附屬醫院檢驗科 鄭州 450052 3)鄭州大學檢驗系 鄭州 450052

膀胱癌指發生在膀胱黏膜的惡性腫瘤, 可發生于任何年齡，發病率、死亡率高，男性膀胱癌發病率為女性的3～4倍[1]。研究膀胱癌的發病機制，找到可診斷和治療膀胱癌的生物標志物尤為重要。微小RNA(miRNA)是一種大小為18～25個核苷酸的非編碼RNA，它通過抑制蛋白質翻譯或促進mRNA降解來調節基因的表達，進而調控細胞的增殖、分化、凋亡等[2]。黏結合蛋白多糖-2(syndecan-2)屬于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)家族，在絕大多數上皮和非上皮源性腫瘤中表達。多配體蛋白聚糖家族廣泛參與細胞的增殖、分化、血管生成等，與癌癥的發生發展密切相關[3]。有研究[4-7]表明，一些miRNA可以調控HSPG的合成和降解，從而影響HSPG的表達，參與腫瘤的發展。本研究旨在探討miRNA-145對膀胱癌細胞中syndecan-2的調控作用及對細胞增殖、分化的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑與儀器人膀胱移行細胞癌細胞株T24購自蓋寧生物公司。轉染脂質體RNAi-MAX、miRNA-145前體購自美國Thermo Fisher Scientific公司，總RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自北京天根公司，熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物和syndecan-2 siRNA由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，細胞增殖檢測試劑盒購自美國Promega公司，細胞衰老檢測試劑盒購自美國Abnova公司，凋亡檢測試劑盒購自美國Millipore公司。ABI 7500全自動熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)，Nikon50i顯微鏡圖文系統(日本Nikon公司)。

1.2細胞培養T24細胞培養于無血清細胞培養基，添加含體積分數15%胎牛血清和青鏈霉素雙抗，于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養。

1.3轉染miRNA-145對T24細胞增殖、分化的影響(實驗Ⅰ)

1.3.1 實驗分組 T24細胞分為2組，空白對照組不處理；轉染miRNA-145組根據轉染說明書，使用脂質體RNAi-MAX轉染，加入miRNA-145前體，以提高miRNA-145的表達。

1.3.2 細胞增殖檢測 轉染24、48和72 h后，采用MTT法檢測2組細胞492 nm處的吸光度并在鏡下觀察細胞增殖情況。實驗重復3次，下同。

1.3.3 細胞中syndecan-2及多種細胞分化標志物mRNA表達的檢測 轉染72 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態；采用熒光定量PCR檢測2組細胞中syndecan-2，鱗狀細胞標志物(P63、TP73和CK5)，腺狀細胞標志物(MUC-1、MUC-3)，神經內分泌細胞標志物(NSE、UCHL-1、CGA)，干細胞標志物(NANOG、OCT3、 SOX2和 E2F4)mRNA的表達。引物序列見表1。用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄為cDNA，-80 ℃保存。反應體系:cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL, ROX Reference Dye(50×)0.1 μL，SYBR Premix Ex Taq(2×)(Til RNaseH Plus)10 μL, dH2O 7.1 μL。循環參數:95 ℃30 s;95 ℃5 s, 60 ℃34 s, 共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

表1 基因引物序列

1.4轉染syndecan-2siRNA對T24細胞衰老、凋亡及分化的影響(實驗Ⅱ)

1.4.1 細胞分組 T24細胞分為2組，空白對照組不處理；轉染syndecan-2 siRNA組參考1.3.1中轉染方法，轉染100 ng/L syndecan-2 siRNA。syndecan-2 siRNA序列是5’-GAAGACTGCTCCGGACCTAGC-3’。

1.4.2 細胞衰老和凋亡檢測 ①采用衰老相關β-半乳糖苷酶法檢測細胞衰老，按照細胞衰老檢測試劑盒說明書操作。轉染72 h后，吸取2組細胞各1 mL，用PBS洗滌3次后棄上清，按照細胞衰老檢測試劑盒說明書，加入染色固定液，室溫固定15 min后用PBS漂洗3次，棄上清，加入染色工作液，37 ℃孵育過夜。顯微鏡下觀察，計數高倍鏡下100個細胞中藍染細胞(衰老細胞)個數，計算細胞衰老率。②采用TUNEL法檢測細胞凋亡，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作。轉染72 h，收集2組細胞制備細胞涂片，室溫固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，加封閉液，再漂洗，浸入細胞膜通透液，漂洗后進行標記反應，最后DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，整個實驗在避光條件下進行。計數高倍鏡下100個細胞中染成棕色的細胞(凋亡細胞)個數，計算細胞凋亡率。

1.4.3 細胞中syndecan-2及細胞分化標志物mRNA表達的檢測 轉染72 h后，參照1.3.3方法檢測2組細胞中syndecan-2及MUC-1、TP73、NANOG、NSE mRNA的表達。

1.5統計學處理用SPSS 22.0處理數據。采用2×3析因設計的方差分析比較實驗Ⅰ2組細胞增殖能力的差異，采用兩獨立樣本t檢驗比較實驗Ⅰ和實驗Ⅱ轉染組細胞與空白對照組其他指標的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1實驗Ⅰ2組細胞增殖檢測隨轉染時間的延長，2組細胞吸光度升高；與空白對照組比較，轉染miRNA-145組吸光度降低(表2)。

表2 實驗Ⅰ細胞增殖情況比較

F組間=34.105，P<0.001；F時間=46.834，P<0.001；F交互=8.562，P<0.001

2.2實驗Ⅰ2組細胞形態學表現及細胞分化標志物、干細胞標志物mRNA表達的比較與空白對照組相比，轉染miRNA-145組細胞在轉染72 h后出現類似腺狀細胞的膨脹細胞質及類似神經內分泌細胞的細長軸突(圖1)；同時，鱗狀細胞標志物(P63、TP73和CK5)，腺狀細胞標志物(MUC-1、MUC-3)，神經內分泌細胞標志物(NSE、UCHL-1、CGA)及干細胞標志物(NANOG、OCT3、SOX2和 E2F4)mRNA的表達均增加(表3、4)。空白對照組和轉染miRNA-145組syndecan-2 mRNA的表達水平分別為(1.00±0.19)和(0.52±0.16)，差異有統計學意義(t=3.347,P=0.029)。

A:空白對照組；B:轉染miRNA-145組腺狀細胞樣改變；C：轉染miRNA-145組神經內分泌細胞樣改變

組別鱗狀細胞標志物TP73P63CK5腺狀細胞標志物MUC-1MUC-3神經內分泌細胞標志物NSEUCHL-1CGA空白對照組1.00±0.121.00±0.321.00±0.541.00±0.891.00±0.191.00±0.661.00±0.281.00±0.16轉染miRNA-145組1.65±0.182.03±0.285.87±1.084.73±1.151.94±0.292.59±0.381.94±0.351.67±0.33t5.2044.1966.9864.4434.6963.6163.6323.164P0.0060.0140.0020.0110.0090.0220.0210.034

表4 實驗Ⅰ轉染72 h后 干細胞標志物mRNA表達的比較(n=3)

2.3實驗Ⅱ2組細胞syndecan-2表達的比較空白對照組和轉染syndecan-2 siRNA組syndecan-2 mRNA的表達水平分別為(1.00±0.05)和(0.49±0.04)，差異有統計學意義(t=13.796,P<0.001)。

2.4實驗Ⅱ2組細胞衰老和凋亡情況轉染72 h后，與空白對照組相比，轉染syndecan-2 siRNA組衰老細胞增多，見圖2、表5。

A:細胞衰老;B:細胞凋亡;1:空白對照組;2:轉染syndecan-2 siRNA組

2.5實驗Ⅱ2組細胞分化標志物和NANOGmRNA表達的比較轉染syndecan-2 siRNA組細胞主要分化標志物和干細胞分化標志物NANOG mRNA的表達增加(表6)。

表6 實驗Ⅱ2組細胞 分化標志物mRNA表達的比較(n=3)

3 討論

膀胱癌占我國泌尿生殖系腫瘤發病率和死亡率的第一位，深入研究膀胱癌發生、發展相關的標志物，有助于加深對該病的認識，同時也能為尋找新的治療手段提供理論依據[8]。

miRNA-145是miRNA中的一種，位于人5號染色體長臂的3區2帶(5q32)[9]，它在結直腸癌、肺癌、前列腺癌和食管癌中的表達降低[10-15]，可能是一種腫瘤抑制物。有研究[16]表明miRNA-145可通過抑制某個靶點而抑制原癌基因的激活，而原癌基因被激活后也可抑制miRNA-145的表達，使其不能發揮正常功能。miRNA-145能夠抑制多種癌基因表達從而抑制癌細胞的增殖、侵襲、轉移，在肺腺癌中抑制表皮生長因子和NUDT1[17]，在食管鱗狀細胞癌中抑制Fascin-1[18]、在肝癌中抑制胰島素樣生長因子[19]。該研究結果顯示上調miRNA-145后T24細胞增殖能力減弱，說明其在膀胱癌增殖、發展中起負性調節作用，這與之前的研究結果一致。此外，研究結果還顯示， miRNA-145能使T24細胞分化為具有干細胞特征的多能細胞，這也印證了前人關于miRNA有將癌細胞重新誘導為干細胞樣細胞的潛能的報道[20]。

此外，本研究結果顯示上調miRNA-145后T24細胞中syndecan-2表達下降。syndecan-2是一種跨膜蛋白多糖，是HSPG家族中的一員，其核心蛋白部位的多功能區與糖胺聚糖鏈的胞外配體及胞膜受體相結合，介導胞內外信號傳導，與腫瘤的分化、發展密切相關[21]。syndecan-2從腫瘤細胞表面脫落，其N端的亮氨酸殘基可被MMP-7剪切[22]，脫落在培養基或基質中的胞外段能提高癌細胞黏附和侵襲能力。有研究[23]表明syndecan-2在結腸癌細胞株中處于高表達狀態，蛋白表達越高，癌細胞侵襲力越強。另有研究[24]顯示syndecan-2對于腫瘤發生和前列腺腫瘤干細胞的再生至關重要。在乳腺癌中miRNA-145能夠調控syndecan-2的表達，影響乳腺癌細胞的遷移[25]。本研究結果顯示，轉染siRNA建立穩定沉默syndecan-2的細胞株后，細胞主要分化標志物和NANOG mRNA的表達增加，細胞發生衰老，說明下調syndecan-2的表達可誘導細胞衰老和分化。

綜上所述，在膀胱癌T24細胞株中轉染miRNA-145，可下調syndecan-2表達，誘導細胞衰老和分化，從而抑制腫瘤增殖。