丙酮酸激酶同工酶M2在膽囊癌組織中的表達及其對膽囊癌細胞生物學活性的影響

陳建安，陳思玉，劉麗文，陳曉龍，朱威威，余 炎，何玉婷，孫冉冉，任志剛，李 娟，崔光瑩，余祖江

鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052

膽囊癌(gallbladder cancer，GBC)是胃腸道系統中第七位高發的惡性腫瘤，同時也是膽道系統中最常見和最具侵襲性的腫瘤[1]。由于其早期無明顯癥狀，故診斷困難，加之易發生遠處轉移，膽囊癌患者的5 a生存率低于5%[2-3]。到目前為止，外科手術切除仍是最有效的治療方法，但是大多數患者在確診時已經失去了最佳手術時間[4]。因此，闡明GBC發生發展機制，探索有效的預后生物分子標志物，可能對膽囊癌的靶向治療有一定的作用。有研究[5]報道，腫瘤細胞能夠通過一種異常的糖代謝行為來躲避細胞凋亡程序，增強自身的增殖和侵襲能力，這種異常的糖代謝行為叫作Warburg效應，是腫瘤得以發生發展的關鍵因素。 丙酮酸激酶同工酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)是丙酮酸激酶的同種型之一，也是糖酵解的關鍵限速酶。近年來大量研究[6-8]證明PKM2與胃癌、舌癌和肝癌等多種腫瘤的發生發展有關；且PKM2過表達與這些患者的預后不良有關，但PKM2在膽囊癌中的表達及作用鮮有報道。為此，作者進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑人膽囊癌GBC-SD和NOZ細胞株購自中國科學院細胞庫。DMEM培養基購自美國 Gibco 公司，標準胎牛血清購自美國HyClone 公司，PKM2和GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，PKM2 siRNA(序列為5’-CCAUAAUCGUCCUCACCAATT-3’)及陰性對照siRNA(序列為5’-CCAGUUUACCUAACGCAAUTT-3’)由上海吉瑪制藥公司設計合成，脂質體轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司， MTT試劑購自碧云天生物技術有限公司，Matrigel膠和Transwell小室購自美國BD公司，DAB溶液購自美國Boster公司，葡萄糖測試試劑盒購自中國普利萊基因技術有限公司，ATP檢測試劑盒購自美國Cayman Chemical公司；乳酸檢測試劑盒購于美國Sigma公司。

1.2膽囊癌組織與癌旁正常組織中PKM2蛋白表達的免疫組化檢測收集2009年4月至2014年4月在鄭州大學第一附屬醫院行膽囊癌手術切除患者的膽囊石蠟包埋組織，包括53例膽囊癌組織和27例癌旁正常組織。組織經過脫苯脫蠟抗原修復等步驟，加兔抗人PKM2抗體(按1∶200稀釋)室溫孵育2 h，PBS洗片后加羊抗兔二抗室溫孵育1 h，用DAB溶液顯示信號。由兩名病理學家以雙盲法進行閱片，在200倍顯微鏡下選取3個視野，參照Remmele評分系統[9]按染色區域百分比進行評分：無染色為陰性(-)，<25%為+，25%～為，50%～為，>75%為。該研究得到了鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會的批準。

1.3細胞培養及轉染GBC-SD和NOZ細胞復蘇后放在含體積分數10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基、37 ℃、體積分數5%CO2的培養箱中進行培養。分別收獲對數生長期的GBC-SD和NOZ細胞接種于6孔板，用脂質體2000分別轉染PKM2 siRNA、陰性對照siRNA，48 h后進行后續實驗。

1.4細胞增殖的MTT法檢測將轉染48 h后的細胞以每孔5×104個/mL的密度接種于96孔板，培養1、2、3、4和5 d后分別加入5 g/L無菌MTT溶液20 μL。37 ℃孵育4 h后棄去上清繼續培養4 h，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，檢測490 nm處的吸光度值。每組均設3個復孔。

1.5細胞中PKM2表達的免疫熒光法檢測將GBC-SD和NOZ細胞以每孔2×105個/mL的密度接種于24孔板，孵育24 h后取出細胞爬片，待40 g/L多聚甲醛固定及體積分數10%山羊血清室溫孵育2 h后，加入體積分數1% PBS稀釋的PKM2(按1∶50稀釋)并4 ℃搖床過夜。PBS洗3遍，加熒光二抗IgG室溫孵育1h。熒光顯微鏡下拍照，定位PKM2的表達。

1.6細胞中PKM2表達的Westernblot檢測用RIPA裂解蛋白提取試劑(碧云天生物技術有限公司)和蛋白酶抑制劑(美國羅氏公司)收集細胞和細胞裂解物，取等量的蛋白質在SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂乳和體積分數0.1%吐溫20 TBS封閉1 h，分別加入PKM2一抗(按1∶1 000稀釋)、β-actin一抗(按1∶5 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌3次，經二抗孵育1 h并洗滌后，將膜暴露。結果用Image J軟件進行分析。以目的蛋白和內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.7細胞體外侵襲能力的Transwell小室檢測將50 μL Matrigel膠鋪在孔徑為8 μm的24孔Transwell小室的上室，37 ℃放置8 h。上室加入105個細胞，總體積200 μL，下室加入300 μL含血清培養基，每組設置3個復孔，48 h后取出小室，甲醇固定并用結晶紫染色孵育10 min后，去除上層小室側的未遷移的細胞，觀察達到遷移杯底下面的細胞。顯微鏡下選取5個視野，計算每個視野的平均細胞數。

1.8細胞糖代謝的檢測將轉染48 h后的細胞以每孔105個接種于12孔板，并加入1 mL DMEM培養基，6 h后將培養基改為低糖的DMEM培養。24 h后分別用葡萄糖測試試劑盒、乳酸檢測試劑盒和ATP檢測試劑盒測定葡萄糖、乳酸和ATP的濃度。

1.9統計學處理采用SPSS 23.0和GraphPad 6.0進行分析。應用秩和檢驗比較膽囊癌和癌旁正常組織中PKM2蛋白表達的差異，應用兩獨立樣本t檢驗比較PKM2 siRNA和陰性對照組細胞中PKM2蛋白表達水平、細胞增殖、侵襲和糖代謝水平的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1膽囊癌和癌旁正常組織中PKM2蛋白的表達水平見表1。免疫組化結果顯示膽囊癌組織中PKM2蛋白的相對表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義(Z=4.760，P<0.001)。

表1 膽囊癌及癌旁正常組織中PKM2蛋白的表達

Z=4.760，P<0.001

2.2PKM2siRNA轉染對膽囊癌細胞增殖能力的影響見圖1。由圖1可知，轉染PKM2 siRNA后，GBC-SD和NOZ細胞的增殖能力均下降。

圖1 膽囊癌細胞增殖曲線

2.3PKM2siRNA轉染時膽囊癌細胞中PKM2蛋白的定位及表達的影響見圖2和表2。免疫熒光結果顯示PKM2蛋白只在GBC-SD和NOZ細胞的胞質中表達，胞核中無表達。Western bolt結果顯示PKM2 siRNA組GBC-SD、NOZ細胞中PKM2蛋白的相對表達量均低于陰性對照組。

圖2 轉染細胞中PKM2蛋白的 免疫熒光(上)、Western bolt(下)檢測結果

組別nGBC-SD細胞NOZ細胞陰性對照組30.96±0.030.98±0.01PKM2 siRNA組30.17±0.030.22±0.04t32.25231.926P<0.001<0.001

2.4PKM2siRNA轉染對膽囊癌細胞侵襲能力和細胞糖代謝能力的影響見圖3和表3。由圖3和表3可知，PKM2 siRNA組GBC-SD和NOZ細胞侵襲能力均受到抑制，葡萄糖消耗量、細胞外乳酸生成和ATP消耗量均下降。

圖3 細胞侵襲實驗(×100)

組別nGBC-SD細胞穿膜細胞數c(葡萄糖消耗量)/(mmol/L)c(細胞外乳酸生成量)/(mmol/L)ATP消耗量/(μmol/g)NOZ細胞穿膜細胞數c(葡萄糖消耗量)/(mmol/L)c(細胞外乳酸生成量)/(mmol/L)ATP消耗量/(μmol/g)陰性對照組3214.6±18.1510.10±0.729.65±0.72106.30±8.87177.1±10.859.99±0.619.44±0.61117.26±12.13PKM2 siRNA組3122.7±22.203.93±0.205.13±0.4147.01±7.0976.2±9.583.57±0.264.13±0.3544.35±3.52t5.5518.0755.8545.22212.0709.7238.3435.779P0.0050.0010.0040.006<0.001 <0.0010.0010.005

3 討論

我國膽囊癌發病率居膽道腫瘤首位，位列消化道腫瘤第7位，且好發于50～70歲，與慢性膽囊炎、膽石癥具有密切的關系[10]。由于膽囊癌早起缺乏特異性的臨床表現，以及缺少有價值的臨床檢測方法，其診斷常被延誤。因此，探索新的能夠早期預測膽囊癌的生物學分子指標具有重要的臨床意義。

即使在有氧條件下，大多數腫瘤細胞仍然選擇糖酵解方式獲取能量，這種現象被稱為Warburg效應[11]；該文獻報道，Warburg效應在惡性腫瘤進展中具有重要作用，有望成為腫瘤治療的重要靶點。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的主要限速酶之一，能夠使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP變為丙酮酸和ATP。與線粒體呼吸不同的是，丙酮酸激酶的能量再生與氧氣供應無關[12]。PKM2是丙酮酸激酶的一種重要的同工酶，常在一些分化的組織中以及在具有高核酸合成率的細胞中表達，如肺組織、脂肪組織和正常增殖細胞、胚胎細胞，尤其是腫瘤細胞[13-14]。

有研究[15]報道PKM2在癌細胞葡萄糖代謝過程中具有重要的作用，也可作為蛋白激酶、轉錄因子等調控腫瘤細胞的增殖和轉移，是腫瘤代謝和細胞功能的樞紐蛋白分子。同時PKM2在許多癌細胞中高表達，與惡性腫瘤進展及轉移有著密不可分的關系。朱珠等[16]的研究結果顯示，PKM2能夠通過調控腫瘤細胞糖代謝來促進胃癌的發生發展。Wei等[17]的研究證實，沉默PKM2后，乳腺癌細胞的增殖能力顯著下降，并且細胞凋亡率增加。何中林等[18]發現在肝癌組織中，PKM2的高表達提示預后不良。本研究結果表明，PKM2在膽囊癌組織中高表達。利用干擾RNA手段沉默PKM2的表達后，GBC-SD和NOZ細胞的增殖能力、侵襲能力均顯著下，同時兩種細胞的葡萄糖消耗量、細胞外乳酸生成量和ATP消耗量均明顯減少，上述結果提示PKM2可能是通過介導Warburg效應促進膽囊癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，PKM2可能與膽囊癌細胞的增殖、侵襲等密切相關，可作為一個潛在的提示膽囊癌進展的生物標志物和治療干預的靶標。