CYP3A4 rs4646440與rs2242480及CYP3A5 rs776746連鎖不平衡分析及其對肝組織CYP3A4表達及活性的影響

何悅洋，李江峰，聶亞莉，張 弛，馬亞楠，顧思夢，洪春麗，楊衛紅，張莉蓉

1) 鄭州大學基礎醫學院臨床醫學系 鄭州 450001 2) 鄭州大學基礎醫學院機能實驗中心 鄭州 450001 3) 鄭州大學基礎醫學院藥理學系 鄭州 450001 4) 鄭州大學基礎醫學院法醫學系 鄭州 450001

CYP3A是一種重要的CYP450酶系，在人肝組織內含量豐富，主要包括CYP3A4和CYP3A5，可代謝許多臨床藥物。已知編碼CYP3A基因的遺傳變異是引起臨床上CYP3A代謝藥物在不同個體間藥效差異和藥物安全性的重要因素[1-2]。體內外研究[3-9]表明，CYP3A4基因的遺傳變異CYP3A4*22、CYP3A4*1G(rs2242480)可通過影響CYP3A4的表達與活性從而影響藥物的療效。rs4646440位于rs2242480下游，兩者均位于CYP3A4內含子10中[10]。有文獻[11]報道rs4646440與患者美沙酮維持治療的嚴重副作用和戒斷癥狀有關。已知rs2242480與CYP3A5 rs776746(CYP3A5*3)存在較強的連鎖不平衡關系。本研究的主要目的是探討rs4646440與rs2242480、rs776746之間的連鎖關系及其與CYP3A4表達和活性的關系，以期闡明不同個體間CYP3A4活性差異的機制，為臨床個體化用藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料54例成人正常肝組織標本來源于鄭州大學第一附屬醫院肝膽外科手術患者，均為病灶周圍的正常肝組織，研究方案得到該院倫理委員會的批準，患者已簽署知情同意書。主要試劑與儀器：基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，PCR試劑盒(TaKaRa公司)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 熒光定量試劑盒(大連寶生物技術有限公司)，引物合成由Life Technologies(上海)貿易有限公司完成，PCR擴增儀(德國Biometrd公司)，水平電泳槽(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(美國Syngene公司)，高效液相色譜(HPLC)儀(美國Waters公司)，7500 Fast實時熒光定量 PCR 系統(美國ABI公司)，咪達唑侖和1-OH咪達唑侖(北京匯智泰康醫藥科技公司)。

1.2基因分型用DNA提取試劑盒從肝組織標本中提取DNA。PCR所用引物由作者設計或來自參考文獻[10,12],引物序列及相關信息見表1。PCR反應體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，補充ddH2O至25 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳初步驗證后送Life Technologies(上海)貿易有限公司測序，并將測序結果與NCBI預期序列進行比對。

表1rs4646440、rs2242480、rs776746PCR引物

引物序列 (5’-3’)產物大小/bprs4646440上游:GTCCCCTTAGCTGTATCCAC下游:CCTGGTTCCTAGCTTGGCTT433rs2242480上游:CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT下游:AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC287rs776746上游:CATGACTTAGTAGACAGATGAC下游:GGTCCAAACAGGGAAGAAATA293

1.3CYP3A4mRNA表達的測定提取22例肝組織中的總 RNA后反轉錄成 cDNA。CYP3A4及內參基因GAPDH引物均來自文獻[11,13]，見表2。Real-time PCR 反應體系：SYBR mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板cDNA 2 μL。反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 40 個循環。采用 SYBR 染料法在實時熒光定量 PCR 儀上檢測 mRNA 的表達，以2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達水平。

表2CYP3A4及GAPDHPCR引物

引物序列 (5’-3’)產物大小/bpCYP3A4上游:GCAGGAAAGCTCCATGCACATAG下游:GAGAAGCCAGGTTTCCATGG132GAPDH上游:GTCAGTGGTGGACCTGACCT下游:TGAGCTTGACAAAGTGGTCG212

1.4HPLC法測定CYP3A4的活性取22例肝組織樣本，參照文獻[14]，用差速離心法制備肝微粒體，BCA法測定微粒體蛋白含量。以咪達唑侖作為底物，用HPLC法檢測肝微粒體酶活性，CYP3A4活性用1-OH咪達唑侖生成速度(V)表示。用回歸分析及Eadie-Hofstee 求出CYP3A4活性的參數Vmax。

1.5統計學處理采用SPSS 13.0處理數據。用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用Haploview軟件進行位點連鎖分析，連鎖不平衡的程度用D＇ 和r2表示。用兩獨立樣本t檢驗比較rs4646440 CC組與CT+TT組CYP3A4 mRNA表達水平及CYP3A4活性的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1基因多態性分析rs4646440、rs2242480和rs776746位點的基因型頻率分布見表3。3個位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明群體基因遺傳平衡。等位基因rs4646440 T、rs2242480 A、rs776746 G的頻率分別為16.7%、18.5%和 70.4%。測序結果見圖1。

表3不同位點基因型頻率的分布

位點及基因型病例數(%)χ2Prs4646440 CC37(68.5) CT16(29.6)0.2400.624 TT1(1.9)rs2242480 GG36(66.7) GA16(29.6)0.0180.894 AA2(3.7)rs776746 AA6(11.1) AG20(37.0)0.6750.411 GG28(51.9)

上：rs4646440；中：rs2242480；下：rs776746圖1 3種基因分型結果

2.2不同位點之間的連鎖關系分析結果(圖2)顯示3者之間具有強連鎖不平衡關系，rs4646440與rs2242480的連鎖關系比與rs776746的連鎖關系強，而rs4646440與 rs776746的連鎖關系比rs2242480與rs776746的連鎖關系弱。

2.3不同rs4646440基因型組間CYP3A4mRNA表達水平及CYP3A4活性的比較CC 組與CT+TT組CYP3A4 mRNA表達水平及CYP3A4活性相比，差異無統計學意義。見表4。

左：r2值；右：D′值

組別nCYP3A4 mRNAVmax/[μmol·(min·g)-1]CC組111.45±1.060.33±0.11CT+TT組111.21±0.960.35±0.14t0.1131.504P0.5980.703

3 討論

CYP3A4是人肝臟中最重要的藥物代謝酶，能代謝他汀類降血脂藥、環孢素等抗移植排斥藥物、抗腫瘤藥物、麻醉藥物等50%以上常用的臨床處方藥物，然而這些藥物的療效與副作用在不同個體間存在著明顯的差異。到目前為止，不同個體間CYP3A4表達差異的機制尚不完全清楚。近年來內含子基因多態性調控基因愈來愈受到重視[15-16]。

本研究分析了CYP3A4 rs4646440與rs2242480、CYP3A5 rs776746之間的連鎖關系以及其與CYP3A4表達和活性的關系，結果表明rs4646440與rs2242480位點一樣，具有較高的等位基因頻率：rs4646440 T等位基因頻率為16.7%；并且發現3個位點之間具有強連鎖不平衡關系，其中rs4646440與rs2242480的連鎖關系強于與rs776746的連鎖關系，這可能與前兩個SNP在同一基因(CYP3A4)、同一內含子中，而后者位于CYP3A5 基因有關；rs4646440與rs2242480的連鎖關系支持了Wang等[17]的觀點。然而，rs4646440與rs776746的連鎖關系弱于rs2242480與rs776746，說明前兩者連鎖在CYP3A表達中起的作用可能小于后兩者。

本課題組首次在肝組織水平研究了rs4646440基因多態性與CYP3A4 mRNA表達及活性的關系，發現該SNP與CYP3A4 mRNA表達及活性不相關，說明rs4646440可能與藥物的療效及副作用無關，此結論支持了rs4646440多態性不影響中國癲癇患者用卡馬西平單藥治療時卡馬西平代謝的結論[17]。

總之，本研究結果表明CYP3A4 rs4646440、rs2242480和CYP3A5 rs776746之間存在較強的連鎖不平衡關系，同時還發現rs4646440基因多態性與CYP3A4 mRNA表達水平及活性無關。此結果豐富了CYP3A4基因內含子SNP與酶活性關系之間的研究內容，為將來其他CYP3A4內含子SNP的研究提供了理論基礎。