Cyp4a14基因缺失對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸炎的影響

肖中岳，軒青霞，高 強

1)河南科技大學第一附屬醫院腫瘤科 河南洛陽 471003 2)洛陽市婦女兒童醫療保健中心超聲科 河南洛陽 471023

炎癥性腸病是由多種因素引起的慢性復發性非特異性的炎癥疾病[1]。目前的研究[2-3]顯示，該病的發生是由于多種致病因素破壞了腸道內環境的穩態，使得腸道黏膜的免疫功能發生失調，進而損傷腸道的黏膜屏障，最終導致炎癥性腸病的發生。不同類型的腸道黏膜上皮細胞的協同作用是腸道黏膜屏障形成的基礎，其中杯狀細胞是腸道上皮中的黏液分泌細胞，其分泌的黏液可以有效地保護腸道黏膜，減少腸道黏膜損傷[4-6]。近期研究[7]發現，杯狀細胞減少與人克羅恩病活動期和潰瘍性結腸炎有關。Cyp4a14蛋白是一種肝臟細胞色素P450 ω-羥化酶，在人體中其主要作用是參與中長鏈脂肪酸和前列腺素的氧化代謝[8]。有研究[9]顯示，Cyp4a14蛋白可以破壞體內氧化-抗氧化系統平衡，導致大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)和脂質過氧化物產生，進而促進機體的炎癥反應。本研究通過建立Cyp4a14基因敲除小鼠腸炎模型，探討Cyp4a14基因在腸炎發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級129S1/SvJ種系Cyp4a14野生型(wild type,WT；Cyp4a14+/+)和基因敲除純合型(knockout,KO；Cyp4a14-/-)小鼠(由深圳大學提供)，飼養于河南科技大學第一附屬醫院動物實驗中心，維持室內溫度20～22 ℃，濕度保持在50%左右，室內燈光明暗交替的周期是12 h，給予小鼠足量SPF級混合配方顆粒飼料(購于北京華阜康生物公司)，自由飲水，每日更換新鮮飲水，保持小鼠生活環境清潔衛生及通風良好。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子質量為36 000～50 000)購于美國MP Biomedicals公司。快速DNA提取擴增試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司，PAS染色試劑盒購于美國Sigma公司。總RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司，反轉錄和qRT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

1.2入組準備由于Cyp4a14基因的表達與性別有關[10]，實驗過程中所用小鼠均為雄性。選用WT和KO同窩小鼠作為種鼠，繁殖出的后代可出現WT(Cyp4a14+/+)、雜合子(Cyp4a14+/-)和KO(Cyp4a14-/-)3種表型。剪取小鼠尾巴末端約0.5 cm，按快速DNA提取擴增試劑盒說明書操作抽提DNA，隨后PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因。引物序列：Cyp4a14+/+，5’-TCAGGGTT GAAAAAGAATGAC-3’；Cyp4a14-/-，5’-GCCAGAG GCCACTTGTGTAG-3’；Cyp4a14+/-，5’-TGC CCATTTTTCACACAAAA-3’。Cyp4a14+/+目的片段長299 bp，Cyp4a14-/-目的片段長199 bp，Cyp4a14+/-目的片段長299和199 bp，根據條帶判斷每只小鼠的基因型(圖1)。

表1 引物序列

M：Marker；1：Cyp4a14+/+; 2：Cyp4a14+/-; 3：Cyp4a14-/-

1.3小鼠分組與腸炎模型建造選擇6～8周齡、體重為18～25 g小鼠，通過基因鑒定分為WT組和KO組，各20只，再將WT組和KO組小鼠隨機分成WT對照組、WT DSS組和KO對照組、KO DSS組，每組10只。先將小鼠適應性喂養1周，然后對照組給予高壓滅菌飲用水，DSS組給予含30 g/L DSS高壓滅菌飲用水，自由飲用6 d。各組小鼠給予足量飼料，不再另予飲水。每日定時測量小鼠體重，觀察并記錄小鼠的攝食飲水量、大便性狀以及活動情況等，參照Jackson等[11]的方法進行疾病活動指數(DAI)評分。

1.4取材及血便評分造模結束后處死所有小鼠，剖腹取出全結腸，測量結腸長度并肉眼觀察結腸內容物情況。按照張靜等[12]的方法進行血便評分：0分，無出血；1分，結腸1/3出血；2分，結腸2/3出血；3分，整個結腸內均有出血。用預冷的PBS漂洗后，自遠端結腸始取約0.5 cm，用甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片，用于HE染色、PAS染色及免疫組化染色；再取1.0 cm放入RNA Later液中，-80 ℃保存，用于提取RNA。

1.5結腸組織病理學觀察及評分對結腸組織進行HE染色后，400倍顯微鏡下行細胞計數，每張切片選擇10個視野，然后在每個視野中觀察100個細胞。參照文獻[13]的評分標準對切片進行組織學評分。中性粒細胞和淋巴細胞浸潤：0～3分；潘氏細胞和杯狀細胞脫顆粒：0～2分；上皮細胞反應，如隱窩缺失：0～3分；炎癥病灶：0～3分。各項評分相加得出組織病理學評分，急性炎癥的臨界值為6～7分。

1.6結腸和肝臟組織中Cyp4a14以及炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達的檢測總RNA提取采用Trizol法，測定純度和濃度后取RNA 2 μg，使用TaKaRa試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，-30 ℃凍存備用。冰上制備PCR反應體系，以β-actin作為內參，以Ct值表示結果，每個樣本3個復孔，PCR反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算各指標mRNA的相對表達量。

1.7結腸組織中杯狀細胞計數采用PAS染色法對結腸組織中杯狀細胞進行染色。在400倍顯微鏡下進行杯狀細胞計數，每張切片在黏膜層選擇10個視野，計數每個視野中的杯狀細胞。

1.8統計學處理采用SPSS 20.0進行統計學分析。對照組和DSS組間結腸長度、血便評分、組織病理學評分、杯狀細胞計數和3種炎癥因子、Cyp4a14 mRNA相對表達量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗或校正t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1一般情況觀察及DAI評分KO對照組和WT對照組小鼠每天攝食飲水正常，反應機警，皮毛光澤，體重均增加。KO DSS組小鼠于造模第4天開始出現攝食飲水減少、懶動、體重下降，并伴有稀便、肛周潮濕等現象；造模第6天可觀察到數只小鼠出現血便，但體重下降未超過12%。WT DSS組小鼠于造模第3天相繼出現攝食飲水減少、懶動、精神萎靡、體毛凌亂、稀水樣便、血便以及肛周潮濕等現象；造模第6天，全部小鼠均出現嚴重肉眼血便，體重下降接近25%，但無小鼠死亡。與2個對照組相比，KO DSS組和WT DSS組DAI評分均增高，且WT DSS組增高更明顯(圖2)。

圖2 各組小鼠體重變化(上)及DAI評分(下)比較

2.2結腸長度和血便評分WT對照組、WT DSS組結腸長度分別為(8.07±0.66)、(4.89±0.44) cm(t=11.000,P<0.001)。KO對照組、KO DSS組結腸長度分別為(7.52±0.61)、(5.22±0.47) cm(t=9.449,P<0.001)。WT DSS組、KO DSS組血便評分分別為(2.90±0.32)和(2.20±0.79)，WT對照組和KO對照組均無血便。

2.3結腸組織病理學觀察、評分及杯狀細胞計數KO對照組和WT對照組小鼠組織學觀察可見結腸黏膜結構完整，無炎性細胞浸潤現象，KO對照組小鼠結腸組織中杯狀細胞數量較WT對照組明顯增加；KO DSS組結腸黏膜腺體基本完整，杯狀細胞大而不規則，胞漿內有少量分泌顆粒填充，杯狀細胞數量減少，局部在鏡下可以觀察到少量炎性細胞浸潤或者隱窩破壞，呈輕度炎癥改變；WT DSS組鏡下觀察到黏膜上皮細胞廣泛缺失，局部出現糜爛，腺體多數不完整，黏膜及黏膜下細胞結構排列紊亂，杯狀細胞幾乎消失，炎性細胞廣泛浸潤，呈嚴重炎癥改變(圖3)。各組小鼠結腸組織病理學評分及杯狀細胞計數的比較見表2、3。

圖3 各組小鼠結腸組織HE染色(A～D)和PSA染色(E～H)結果(×400)

組別組織病理學評分杯狀細胞計數WT對照組0.61±0.2019.82±0.54WT DSS組10.70±0.482.10±1.20t61.16742.705P<0.001<0.001

表3 KO組小鼠組織病理學 評分和杯狀細胞計數比較(n=10)

2.4結腸和肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達結果見表4～7。

表4 WT組結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達量的比較(n=10)

表5 KO組結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達量的比較(n=10)

表6 WT組肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達量的比較(n=10)

表7 KO組肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達量的比較(n=10)

2.5結腸和肝臟組織中Cyp4a14mRNA的表達無論是WT組還是KO組小鼠結腸組織中均檢測不到Cyp4a14 mRNA的表達；WT DSS組小鼠肝臟組織中Cyp4a14 mRNA的表達較WT對照組下降[(1.0±0.1)和(9.3±0.1)，t=8.852，P<0.001]。

3 討論

Cyp4a14蛋白的主要作用是參與脂肪酸代謝、調節脂質過氧化及氧化應激，從而參與炎癥反應[9，14]。Cyp4a14在機體炎癥反應過程中存在兩種截然相反的作用：在嚴重感染過程中，機體通過降低Cyp4a14的表達達到自身穩態，在炎癥損害發生之前削弱或終止炎癥反應，保護機體避免感染等損害；然而，減弱的炎癥反應有利于細菌侵入機體逃避免疫系統的清除，進而發展為更為嚴重的感染[15-17]。本研究結果顯示，WT對照組和KO對照組小鼠生長發育良好，體重增加；KO DSS組小鼠出現稀便、肛周潮濕現象，體重下降；WT DSS組小鼠出現精神萎靡、血水樣便，體重急劇下降。DAI評分、結腸長度、血便評分和組織病理學結果顯示：與KO對照組相比，KO DSS組小鼠DAI評分增高，結腸縮短，出現結腸血性內容物，病理學呈輕度炎癥改變；WT DSS組小鼠與KO DSS組相比DAI評分進一步增高，結腸縮短最多，出現全結腸血性腸內容物小鼠增多，病理學呈嚴重炎癥改變。以上各方面結果顯示Cyp4a14基因敲除后小鼠對DSS誘導的結腸炎反應敏感性下降，說明Cyp4a14基因的缺失會減輕小鼠結腸的炎癥反應，與以往研究[17]結果一致。

腸道是人體最大的細菌儲存器官和病原微生物、毒素侵入機體的主要門戶，杯狀細胞是腸上皮中的黏液分泌細胞，其分泌的黏液可發揮保護和潤滑腸道的作用，是形成腸黏膜屏障的重要組成部分[18]。有研究[19-20]顯示，寄生蟲感染的小鼠結腸中IL-13和IL-14可導致杯狀細胞病理性增生和黏蛋白過度分泌。當外界有病原體進入時，腸道做出應激反應，杯狀細胞分泌黏液量增加，隨著病程的發展，細胞數量逐漸下降，分泌能力也將下降，使腸道抵抗外界侵襲的能力減弱[21-22]。本研究中發現，KO DSS組小鼠結腸組織中杯狀細胞數量多于WT DSS組，可能正是由于杯狀細胞數量的增加，使KO DSS組小鼠結腸炎癥反應輕于WT DSS組小鼠。

炎癥性腸病患者及動物模型中腸道黏膜ROS及RNS產生均增加，且ROS常在疾病早期階段出現，與疾病的嚴重程度及進展均有關[23]。ROS可以激活NF-κB，介導產生大量炎癥因子，如 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等，促進炎癥反應[24-26]。本研究中，在DSS誘導下，結腸和肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達均增加，且在結腸組織中的表達量均高于肝臟，尤其以IL-6為著。本研究中還發現，在KO和WT小鼠結腸組織中均檢測不到Cyp4a14的表達，Cyp4a14主要表達在肝臟中。以上結果提示，肝臟組織中促炎因子的增加可能是通過肝腸循環由腸道炎癥反應誘導而來。

總之，Cyp4a14基因的缺失對小鼠結腸炎癥的發生具有一定的保護作用。這可能是由于Cyp4a14基因敲除影響了小鼠結腸組織中杯狀細胞的分化，使腸道內杯狀細胞數量增多，從而加強了腸道對外界刺激的抵抗能力。但Cyp4a14基因影響小鼠結腸組織杯狀細胞分化的具體機制仍不十分清楚，尚需進一步研究。