食管鱗癌組織中E-cadherin蛋白表達及對術后預后的影響

韓少華，萬里新，李秀敏，王海玲，董金城，靳 艷，)，楊 洋,)，肖凡凱，宋 昕 ，

胡守佳1)，趙學科1)，王建坡7)，王立東1)

1) 鄭州大學第一附屬醫院河南省食管癌重點開放實驗室；省部共建食管癌防治國家重點實驗室 鄭州 450052 2) 南陽市中心醫院腫瘤科 河南南陽 473003 3) 新鄉醫學院第三附屬醫院胃腸科 河南新鄉453003 4) 淇縣人民醫院內科 河南淇縣 456750 5) 新鄉醫學院基礎醫學院組織學與胚胎學教研室 河南新鄉453003 6) 鄭州大學基礎醫學院病理學與病理生理學教研室 鄭州450001 7)安陽市腫瘤醫院腫瘤防治辦公室 河南安陽455000

食管癌是世界上最常見的九大惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居高不下，發現晚和復發轉移一直是食管癌研究的重大難題[1-2]。中國作為食管癌高發國家之一，其病理類型主要為鱗癌。E-cadherin是鈣黏附蛋白家族的成員之一，是一種細胞骨架黏蛋白，在正常上皮組織中發揮調控細胞分化，維持細胞結構完整性和極性等重要作用。近年來的研究[3-4]表明，E-cadherin的表達減少或丟失與腫瘤臨床病理表現有一定關系，然而，E-cadherin蛋白表達對食管癌預后的影響仍存在爭議。本研究利用50萬例食管癌和賁門癌臨床信息數據庫的資料，在大樣本的基礎上分析E-cadherin蛋白表達與食管鱗癌患者術后預后的關系，報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象從河南省食管癌重點開放實驗室50萬例食管癌和賁門癌臨床信息數據庫中選取1985年至2016年入庫的研究對象。納入標準：確診為食管鱗癌且經手術治療，術前均未接受過針對腫瘤的治療(化療、放療等)，臨床病理信息完整且組織標本經HE染色、顯微鏡觀察確認細胞結構完整、無壞死。排除脫片造成的不能判斷免疫組化染色結果者。入組患者5 620例，男3 652例，確診年齡(60.4±8.4)歲，女1 968例，確診年齡(61.5±8.0)歲；參考UICC/AJCC制定的第6版食管癌TNM分期標準，Ⅰ期221例,Ⅱ期2 828例,Ⅲ期2 343例,Ⅳ期228例；浸潤程度：黏膜層185例，肌層1 324例，纖維膜3 998例，纖維膜外113例；淋巴結轉移陽性2 568例，陰性3 052例；組織分化程度：高分化485例，中分化3 209例，低分化1 926例。

1.2食管鱗癌組織中E-cadherin蛋白的檢測將入選患者蠟塊標本中癌組織集中區域進行標記并設計7×16微列陣，以0.15 mm直徑打孔，重新制成組織芯片模型并固定，然后進行免疫組化染色。兔抗E-cadherin抗體(GB13083-1，1∶500)、PBS(pH 7.4)、檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)、免疫組化染色試劑盒(G1210-2)均為武漢Servicebio技術開發有限公司產品。按照試劑標準流程進行實驗。石蠟切片經二甲苯、無水乙醇梯度脫蠟至水，檸檬酸抗原修復，體積分數3%雙氧水避光孵育以阻斷內源性過氧化物酶，BSA血清封閉，加兔抗E-cadherin抗體4 ℃孵育過夜，加二抗(G1210-2,即用型)，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。以已知的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照，400倍光鏡下觀察。E-cadherin蛋白免疫陽性細胞表現為細胞膜棕黃色顆粒狀均質著色，細胞質幾乎不著色。結果判定采用本實驗室已建立的ABC法[5-6]。根據陽性細胞染色程度判定：無染色為0分；胞膜有淡黃色顆粒，明顯高于背景者為1分；有較多棕黃色顆粒者為2分；有大量深棕黃色顆粒者為3分。每張切片于400倍鏡下計數全部陽性細胞數和細胞總數，計算陽性細胞百分比，<5%為0分，5%～為1分，25%～為2分，≥75%為3分。兩項評分相加，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4分以上為強陽性。

1.3隨訪確診后開始跟蹤隨訪，記錄患者死亡時間及死亡原因，隨訪截止時間為2018年6月8日，終點事件為死亡。隨訪方式有電話隨訪、走訪入戶調查、村醫及村干部問詢、腫瘤登記冊查詢等。

1.4統計學處理采用SPSS 21.0進行分析。不同臨床特征患者癌組織中E-cadherin蛋白表達的比較采用秩和檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制不同臨床病理特征患者的生存曲線并進行log-rank檢驗；采用Cox回歸模型篩選食管鱗癌術后預后的獨立影響因素。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1食管鱗癌組織中E-cadherin蛋白的表達免疫組化染色結果見圖1。不同臨床病理特征食管鱗癌患者癌組織中E-cadherin蛋白表達的比較見表1、2。

A:陰性；B弱陽性；C：強陽性

臨床病理特征 nE-cadherin表達陰性弱陽性強陽性Z/H(P) 確診年齡 <60歲 ≥60歲1 8101 8423663371 0001 0594444460.700(0.482)浸潤程度 黏膜層100175825 肌層 纖維膜7882 6791465234361 5182066381.770(0.621) 纖維膜外85174721淋巴結轉移 陰性 陽性1 9231 7293923111 1319284004904.618(<0.001)分化程度 高分化2954220647 中分化2 0743411 19054323.560(<0.001) 低分化1 283320663300病理分期 Ⅰ期130208624 Ⅱ期 Ⅲ期1 7791 5833662941 04185437243526.620(<0.001) Ⅳ期160237859

表2 不同臨床病理特征女性食管鱗癌患者癌組織中E-cadherin表達的比較

男性患者中，分化程度低、淋巴結轉移陽性、病理分期高的患者E-cadherin表達強于分化程度高、淋巴結轉移陰性、病理分期低者(P<0.05)。女性患者中，淋巴結轉移陽性、病理分期高的患者E-cadherin表達強于淋巴結轉移陰性、病理分期低者(P<0.05)。

2.2術后預后影響因素分析Kaplan-Meier生存分析結果見表3、表4。男性患者中，E-cadherin不同表達組間生存曲線有差異，表達越強，中位生存期越短。而女性患者中，E-cadherin不同表達組間生存曲線差異無統計學意義。

Cox回歸分析變量賦值見表5。回歸分析結果(表6、7)顯示： E-cadherin表達不是食管鱗癌女性患者術后預后的獨立影響因素(P=0.089)，但是男性患者術后預后的獨立危險因素(P<0.001)。

表3 不同臨床病理特征男性食管癌患者的Kaplan-Meier生存分析

表4 不同臨床病理特征女性食管癌患者的Kaplan-Meier生存曲線的比較

表5 變量賦值表

表6 食管鱗癌男性患者 術后預后影響因素的Cox回歸分析結果

表7 食管鱗癌女性患者 術后預后影響因素的Cox回歸分析結果

3 討論

E-cadherin是鈣黏蛋白家族成員，是一種重要的跨膜糖蛋白，其基因位于第16號染色體，其與連接素(α、β、γ-catenin)結合形成復合物，介導細胞間黏附，維持上皮組織結構和功能，被認為是細胞間黏附連接、維持細胞極性和組織完整性的重要蛋白[7]。E-cadherin表達低下導致的復合物功能障礙，可影響細胞間黏附。

腫瘤細胞分化程度降低，則極性喪失，細胞間連接減弱，容易發生轉移，與腫瘤細胞的侵襲轉移和預后不良有關[8]。本研究結果顯示，E-cadherin表達與食管鱗癌的組織分化程度、淋巴結轉移有關。但是Luo和Siitonen等[9-10]研究發現某些生物標記物在原發腫瘤和配對轉移淋巴結組織中的表達并不一致，E-cadherin在轉移淋巴結中的表達強于原發腫瘤組織。因此腫瘤組織中E-cadherin的表達與腫瘤侵襲、轉移的關系還有待進一步研究。

研究[11-13]證實，E-cadherin和連接素的共同作用與食管癌的預后相關。Ishiguro等[3]則認為癌組織中β-catenin的表達與食管癌患者的預后無關，而E-cadherin與β-catenin則協同起作用，影響食管癌患者的預后。因此，目前人們對E-cadherin表達評判食管癌預后的價值看法不一。本研究利用大樣本、長時間隨訪數據，對癌組織中E-cadherin表達與食管鱗癌患者術后生存狀況的關系進行了探討，結果顯示，E-cadherin陽性表達是男性食管鱗癌患者術后預后的獨立危險因素，但不是女性患者的術后預后影響因素。多項研究[14-16]結果顯示，女性食管鱗癌患者的術后生存狀況優于男性，這一現象可能與女性體內激素水平、受體水平、婚育狀態有關。

分子生物學指標是精準預防、精準治療、個體化治療的必然條件。本研究結果提示E-cadherin是男性食管鱗癌患者術后預后的獨立影響因素，但其分子機制仍不清楚，有待進一步研究。此外單一指標能否對預后做出準確的判斷，也值得進一步探討。