不同溶媒注射用還原型谷胱甘肽的肌肉刺激性實驗

潘望平，鄔姍，呂曉君，何開勇

(湖北省藥品監督檢驗研究院生物安全檢測中心，武漢 430064)

注射用還原型谷胱甘肽是用于抗癌藥物解毒、放療損傷預防，對酒精性肝中毒和各種原因引起的肝損傷有保護作用[1-2]。肌肉刺激實驗是肌內注射類藥物的安全性評價檢查項目之一[3]，為保證其臨床用藥的安全、有效，本研究參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》的要求對其進行肌肉刺激實驗[4-6]。注射用還原型谷胱甘肽在臨床使用中是用注射用水或0.9%氯化鈉注射液溶解后進行注射，因此本實驗比較3個廠家的受試藥品用兩種溶媒配制的供試液對家兔的肌肉刺激結果，評價其安全性，為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1受試藥品 注射用還原型谷胱甘肽3批：受試藥品1，規格：每支0.6 g，批號：31504231，武漢大安制藥股份有限公司生產；受試藥品2，規格：每支0.6 g，批號：14021180，重慶藥友制藥有限責任公司生產；受試藥品3，規格：每支0.6 g，批號：131159，意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(原研對照制劑)。人臨床肌肉注射擬用最高濃度為0.3 g·mL-1。溶媒A：0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司，規格：每瓶100 mL，批號：140307703)；溶媒B：滅菌注射用水(武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司，規格：每瓶100 mL，批號：130922-1)。

1.2儀器 動物秤(型號：XS6001S，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；BX53 型顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.3實驗動物 普通級日本大耳白兔96只，雌雄不限，體質量為2.3～2.8 kg，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2011-0011。家兔飼養于湖北省藥品監督檢驗研究院，普通環境，溫度為16～26 ℃，相對濕度40%～70%，實驗動物使用許可證：SYXK(鄂)2014-0009。

1.4動物分組 96只家兔按體質量隨機區組設計方法分成12組，每組8只，按不同生產廠家、溶媒、劑量分別編號為1A-H、1A-L、1B-H、1B-L、2A-H、2A-L、2B-H、2B-L、3A-H、3A-L、3B-H、3B-L，見表1。

1.5受試藥品溶液配制 取注射用還原型谷胱甘肽6支，加0.9%氯化鈉注射液或注射用水至12 mL，濃度為0.3 g·mL-1(大劑量組)；取注射用還原型谷胱甘肽3支，加0.9%氯化鈉注射液或注射用水至12 mL，濃度為0.15 g·mL-1(小劑量組)。

1.6給藥方法 采用同體左右側自身對比法。剪去兩側股四頭肌部位的兔毛，消毒皮膚后，家兔左側股四頭肌給予受試藥品溶液，右側股四頭肌給予溶媒。注射體積均為每側1 mL，單次給藥[7-8]。

1.7觀察指標 于給藥后72 h，每組取4只家兔處死，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察肌肉組織的顏色、光澤，有無充血、水腫、變性或壞死，按肌肉刺激反應分級標準計算相應的反應級，并取兩側注射部位肌肉組織，常規處理，作組織病理學檢查；于給藥后14 d，每組處死剩余4只家兔，同法剖檢觀察局部反應并進行組織病理學檢查，以了解肌肉刺激反應的持續狀況或可逆性。

表1家兔的隨機區組設計方法

Tab.1Randomizedblockdesignmethodofrabbits

組別生產廠家溶媒劑量編號1武漢大安0.9%氯化鈉注射液大劑量1A-H2武漢大安0.9%氯化鈉注射液小劑量1A-L3武漢大安注射用水大劑量1B-H4武漢大安注射用水小劑量1B-L5重慶藥友0.9%氯化鈉注射液大劑量2A-H6重慶藥友0.9%氯化鈉注射液小劑量2A-L7重慶藥友注射用水大劑量2B-H8重慶藥友注射用水小劑量2B-L9意大利福斯卡瑪0.9%氯化鈉注射液大劑量3A-H10意大利福斯卡瑪0.9%氯化鈉注射液小劑量3A-L11意大利福斯卡瑪注射用水大劑量3B-H12意大利福斯卡瑪注射用水小劑量3B-L

1.8結果判定標準 根據肌肉刺激反應分級標準計算肌肉刺激性總反應級，計算平均值，判定刺激等級，并結合組織病理學檢查的結果進行綜合評價。肌肉刺激反應分級標準：無明顯變化，0分；輕度充血，其范圍在0.5 cm×1.0 cm以下，1分；中度充血，其范圍在0.5 cm×1.0 cm以上，2分；重度充血，伴有肌肉變性，3分；出現壞死，有褐色變性，4分；出現廣泛性壞死，5分。平均分值為0.0～0.4，無刺激；0.5～1.4，輕微刺激；1.5～2.4，輕度刺激；2.5～3.4，中度刺激；3.5～4.4，重度刺激；4.5及以上，嚴重刺激。

2 結果

2.1肉眼觀察及評分結果 結果見圖1，2和表2。家兔肌肉注射給藥72 h后，0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組家兔肌肉組織未見異常(圖1A)，無肌肉刺激反應；注射用水溶媒對照組家兔肌肉有中度到重度充血(圖1B)，肌肉刺激反應平均分值為3.0～3.25，說明注射用水作為溶媒對照有中度肌肉刺激反應。受試藥品1(武漢大安)、受試藥品2(重慶藥友)、受試藥品3(意大利福斯卡瑪)用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量藥液在給藥后72 h后，家兔出現不同程度的肌肉刺激反應(圖1C，1G，1K)，平均分值分別為2.25，3.25，1.25，刺激反應分級分別為輕度、中度、輕微；而用注射用水配制的大劑量藥液對家兔肌肉刺激反應平均分值分別為3.5，3.75，3.5，刺激反應分級均為重度刺激(圖1D，1H，1L)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的小劑量藥液對家兔的肌肉刺激反應平均分值分別為0，0.5，0，刺激反應分級分別為無、輕微、無(圖1E，1I，1M)；而用注射用水配制的小劑量藥液對家兔肌肉刺激反應平均分值分別為3.0，3.0，3.5，刺激反應分級均為中度刺激(圖1F，1J，1N)。家兔肌肉注射給藥14 d后，受試藥品2用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量組有1只家兔的注射部位出現白色增生組織(圖2A)，用注射用水配制的大劑量組4只家兔均出現肌肉變性、增生結節組織(圖2B)；0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組、注射用水溶媒對照組、受試藥品1和受試藥品3用兩種溶媒配制的大、小劑量組、受試藥品2用兩種溶媒配制的小劑量組家兔肌肉組織肉眼觀察均未見異常。

2.2組織病理學檢查結果 家兔肌肉注射給藥后72 h肌肉組織病理學檢查結果如圖3所示。0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組的給藥部位肌纖維組織結構完整，無變性、壞死，未見炎癥細胞浸潤現象(圖3A)，注射用水溶媒對照組的給藥部位肌纖維壞死，中度出血及大量炎癥細胞浸潤(圖3B)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量藥液在給藥后72 h后家兔注射部位肌肉組織出現不同程度的出血、炎癥細胞浸潤和肌纖維變性壞死，其中受試藥品2肌纖維壞死程度及范圍最嚴重(圖3G)、受試藥品1 其次(圖3C)、受試藥品3最輕(圖3K)；用注射用水配制的大劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織均出現大量出血及炎癥細胞浸潤，肌纖維大范圍壞死、溶解、變性(圖3E，3I，3M)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的小劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織病理學檢查均未見明顯異常(圖3D，3H，3L)；而用注射用水配制的小劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織均出現中度出血、炎癥細胞浸潤和肌纖維變性(圖3F，3J，3N)。家兔肌肉注射給藥后14 d肌肉組織病理學檢查結果如圖4所示。受試藥品2用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量組有1只家兔的注射部位出現結締組織增生并形成結節(圖4A)，用注射用水的大劑量組4只家兔注射部位均有不同程度結締組織增生并形成結節(圖4B)；0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組、注射用水溶媒對照組、受試藥品1和受試藥品3用兩種溶媒配制的大、小劑量組、受試藥品2用兩種溶媒配制的小劑量組家兔注射部位肌肉組織病理學檢查均未見異常。

A.0.9%氯化鈉注射液組；B.注射用水組；C.1A-H受試藥品組；D.1B-H受試藥品組；E.1A-L受試藥品組；F.1B-L受試藥品組；G.2A-H受試藥品組；H.2B-H受試藥品組；I.2A-L受試藥品組；J.2B-L受試藥品組；K.3A-H受試藥品組；L.3B-H 受試藥品組；M.3A-L受試藥品組；N.3B-L受試藥品組

圖1家兔給藥后72h肌肉刺激肉眼觀察結果(1：2.5)

A.0.9% sodium chloride injection group；B. water for injection group；C. test drug 1A-H group；D. test drug 1B-H group；E. test drug 1A-L group；F. test drug 1B-L group；G. test drug 2A-H group；H. test drug 2B-H group；I. test drug 2A-L group；J. test drug 2B-L group；K. test drug 3A-H group；L. test drug 3B-H group；M. test drug 3A-L group；N. test drug 3B-L group

Fig.1Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation72hoursafterintromuscleinjection(1：2.5)

表2家兔給藥后72h肌肉刺激反應積分和分級

Tab.2Scoresandgradingofmuscularstimulationresponseofrabbits72hoursafterintromuscleinjection

組別家兔/只左側(受試藥品)每只家兔積分平均分等級右側(溶媒)每只家兔積分平均分等級1A-H組433122.25輕度00000無1A-L組400000無00000無1B-H組444333.50重度33343.25中度1B-L組433333.00中度33333.00中度2A-H組433343.25中度00000無2A-L組411000.50輕微00000無2B-H組444433.75重度33343.25中度2B-L組433333.00中度34333.25中度3A-H組422101.25輕微00000無3A-L組400000無00000無3B-H組433443.50重度33343.25中度3B-L組433333.00中度33333.00中度

組別：1.武漢大安；2.重慶藥友；3.意大利福斯卡瑪；A.0.9%氯化鈉注射液；B.注射用水；H.大劑量；L.小劑量

Groups：1.Wuhan，daan； 2.Chongqing，yaoyou； 3.Italy，Foscama；A.0.9% sodium chloride injection； B.water for injection； H.high dose； L.low dose

A.2A-H受試藥品組； B.2B-H受試藥品組

圖2家兔給藥后14d肌肉刺激肉眼觀察結果(1：2.5)

A. test drug 2A-H group；B. test drug 2B-H group

Fig.2Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation14dayafterintromuscleinjection(1：2.5)

3 討論

本實驗觀察3個不同廠家的注射還原型用谷胱甘肽分別用0.9%氯化鈉注射液和注射用水溶解后對家兔進行單次給藥的肌肉刺激作用：受試藥品設置大、小兩個劑量，給藥后72 h和14 d進行大體觀察評分和組織病理學檢查，以比較兩種溶媒配制的受試藥品對家兔肌肉刺激有無差異，并比較3個不同廠家的受試藥品的肌肉刺激性。結果顯示，根據給藥后72 h的大體觀察結果及組織病理學檢查結果進行分級，0.9%氯化鈉注射液作為溶媒時，受試藥品1(武漢大安)、受試藥品2(重慶藥友)、受試藥品3(意大利福斯卡瑪)大劑量組肌肉刺激反應分別為輕度、中度、輕微，小劑量組肌肉刺激反應分別為無、輕微、無；注射用水作為溶媒時，大劑量組肌肉刺激反應均為重度，小劑量組肌肉刺激反應均為中度，說明用注射用水作為溶媒配制受試藥品比0.9%氯化鈉注射液作為溶媒的肌肉刺激反應大，且大劑量比小劑量的肌肉刺激反應大，其中受試藥品2的肌肉刺激性最大，受試藥品1其次，受試藥品3最小。給藥14 d后，大體觀察和病理學結果表明，受試藥品2大劑量對家兔所致的肌肉刺激為不可逆，家兔肌肉有結締組織增生和白色結節，且用注射用水作為溶媒配制受試藥品比0.9%氯化鈉注射液作為溶媒導致的不可逆損傷更為嚴重；受試藥品1和受試藥品3對家兔的肌肉刺激性為可逆的。受試藥品3為意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產，是注射還原型用谷胱甘肽原研對照制劑，在本次實驗中肌肉刺激性最輕，提示我國仿制藥品與原研藥還是存在差別。

3個不同廠家的注射用還原型谷胱甘肽的肌肉刺激結果均顯示注射用水作為溶媒比0.9%氯化鈉注射液的肌肉刺激性大，可能是因為用注射用水配制的藥液為低滲溶液，短時、快速地進入肌肉組織后引起肌細胞腫脹、溶解至72 h后發生變性壞死；而用0.9%氯化鈉注射液配制的藥液為等滲溶液，注射后肌肉刺激較注射用水輕；且注射用水溶媒組亦出現中度肌肉刺激性。因此，用注射用水配制的藥液引起的肌肉刺激反應可能有一部分是來自注射用水而不僅僅是受試藥品，可認為用注射用水配制注射用還原型谷胱甘肽，加重其肌肉刺激反應，建議在臨床使用時用0.9%氯化鈉注射液進行配制。

A.0.9%氯化鈉注射液組；B.注射用水組；C.1A-H受試藥品組；D.1A-L受試藥品組；E.1B-H受試藥品組；F.1B-L受試藥品組；G.2A-H受試藥品組；H.2A-L受試藥品組；I.2B-H受試藥品組；J.2B-L受試藥品組；K.3A-H受試藥品組；L.3A-L受試藥品組；M.3B-H受試藥品組；N.3B-L受試藥品組

圖3家兔給藥后72h肌肉組織病理圖(HE染色，×100)

A.0.9% sodium chloride injection group；B. water for injection group；C. test drug 1A-H group；D. test drug 1A-L group；E. test drug 1B-H group；F. test drug 1B-L group；G. test drug 2A-H group；H. test drug 2A-L group；I. test drug 2B-H group；J. test drug 2B-L group；K. test drug 3A-H group；L. test drug 3A-L group；M.test drug 3B-H group；N. test drug 3B-L group

Fig.3Histopathologicalimagesofrabbitsmuscle72hoursafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

A.2A-H受試藥品組； B.2B-H受試藥品組

圖4家兔給藥后14d肌肉組織病理圖(HE染色，×100)

A. test drug 2A-H group；B. test drug 2B-H group

Fig.4Histopathologicalexaminationofrabbitsmuscle14daysafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

綜上所述，注射用還原型谷胱甘肽用0.9%氯化鈉注射液做溶媒比注射用水的肌肉刺激反應輕，且原研制劑的肌肉刺激最輕。為保障公眾用藥安全和提升我國仿制藥質量提供實驗參考依據。