梔子苷對肺缺血再灌注的保護作用及其與p-Akt和NF-κB表達的關系

杭文地 班佳藝 趙志英(通訊作者)★ 邰美慧 林穎 劉穎 李雪榮

014040內蒙古科技大學包頭醫學院1

014040內蒙古科技大學包頭醫學院麻醉學院2015級麻醉本科班2

014040內蒙古科技大學包頭醫學院麻醉學院2016級麻醉本科班3

肺缺血再灌注損傷(LIRI)是指肺臟血供減少或中斷，重新恢復肺臟血供導致肺組織細胞損傷加劇的病理危象[1]，LIRI可誘發一系列復雜的級聯反應并加重肺損傷，嚴重影響患者的預后。LIRI好發于肺栓塞溶栓、肺移植、介入治療等危重患者。隨著肺栓塞溶栓、肺移植、介入治療等技術的廣泛深入開展，臨床醫生關注的熱點是如何減輕LIRI對肺的損傷。梔子苷為茜草科梔子的主要有效活性成分，近年來研究梔子及有效成分，發現其在心血管系統、消化系統、中樞神經系統及抗炎、抗腫瘤、降血糖方面具有廣泛的藥理作用。Liu等[2]研究發現梔子苷可以阻止由脂多糖(LPS)誘導的人臍帶靜脈內皮細胞(HUVECs)產生白細胞介素6(IL-6)和IL-8。楊奎等[3]研究表明，梔子苷的中、高劑量組均能明顯降低血腫周圍腦組織腫瘤壞死因子IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，抑制ICAM-1的表達，抑制炎性反應上游信號啟動，保護腦出血后炎性反應造成的繼發性腦損傷。涂華等[4]研究發現梔子苷預處理對大鼠腦缺血再灌注引起的損傷具有保護作用。但梔子苷對在體大鼠肺缺血再灌注損傷是否有保護作用，未見研究。為此，本研究探討分析了在大鼠的肺缺血再灌注模型上梔子苷是否具有保護作用，作用機制是否與PI3K/Akt/NF-κB信號通路的表達有關，為臨床上尋求新的治療方案提供依據。

資料與方法

試驗動物：健康清潔級Wistar雄性大鼠120只，體重250～300 g/只，由內蒙古大學試驗動物中心提供。喂養于光照12 h、相對濕度45%～60%、溫度23～25℃的試驗室中。

主要藥品：梔子苷購自中國藥品生物制品檢定所，在武漢博士德生物有限公司購買TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒，兔抗AKT、NF-κB單克隆抗體、β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

方法：⑴動物分組和肺缺血再灌注模型制備：將120只雄性大鼠隨機分為6組，每組20只，分別為假手術組(A)、缺血再灌注模型組(B)、梔子苷低劑量組(25 mg/kg)(C)、梔子苷中劑量組(50 mg/kg)(D)、梔子苷高劑量(100 mg/kg)(E)、梔子苷高劑量(100 mg/kg)+LY294002組(F)。①假手術組：開胸游離左肺門后，未予阻斷后缺血再灌注處理。②缺血再灌注模型組：開胸游離左肺門后，阻斷左肺門45 min，后松開血管夾形成再灌注。③梔子苷低、中、高劑量組：以各劑量分別灌胃7 d，1次/d，第7天灌胃1 h后行手術，開胸游離左肺門后，夾閉阻斷45 min，后松開血管夾形成再灌注。④梔子苷高劑量(100 mg/kg)+LY294002組(F)與梔子苷各劑量組給藥方式相同，在梔子苷灌胃之前給予抑制劑LY294002。⑤假手術組和缺血再灌注模型組采用與梔子苷組和梔子苷+LY294002組相同時間與方法灌注等量生理鹽水。⑵標本采集：每組相同時間點(缺血45 min，再灌注4 h)分別腹主動脈放血處死大鼠20只，留取左肺組織標本。自左側肺門離斷左肺，立即將其放入無菌冷生理鹽水中并洗去血污。切取部分肺組織放入凍存管后立即置于液氮中速凍，然后將其保存在-80℃冰箱中待用。⑶ELISA法檢測大鼠肺組織中的前炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6：取出-80℃冰箱保存的肺組織，取肺組織1 g研磨成粉，以冷的生理鹽水為介質制作組織勻漿，4℃，12 000 r/min，取上清，利用放射免疫計數器測量各組樣品放射強度并制作標準曲線，按照試劑盒操作檢測以上炎性因子的含量變化。⑷Western blot檢測肺組織蛋白表達：按照比例取肺組織，每50 mg肺組織中加入1 mL RI-PA 裂解液(以 1：50加入50×cocktail)，冰上勻漿，提取各組總蛋白。對其進行電泳，采用10%的聚丙烯酰胺凝膠，按說明書進行Western blot試驗，檢測p-Akt、Akt、NF-κB表達。最后進行化學發光反應，將PVDM膜放入按100：1配制的AB發光液中1 min，快速移至暗室，曝光，顯影。用水沖洗X光片，晾干后，用美國UVPGDS8000凝膠成像機測灰度。

數據處理及統計分析：試驗數據均以(x±s)表示，采用統計軟件SPSS22.0進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，用LSD法比較各組均值，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量變化：與模型組比較，應用梔子苷預處理的大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6釋放顯著減少(P＜0.05)。應用了PI3K/Akt信號通路抑制劑后再給予藥物梔子苷，與其他給藥組比較，抑制劑組TNF-α、IL-1β、IL-6釋放增加(P＜0.05)，見表1。

梔子苷對各組大鼠p-Akt表達的影響：與模型組比較，應用梔子苷預處理的大鼠肺組織p-Akt/Akt比值增加。應用了PI3K/Akt信號通路抑制劑后再給予藥物梔子苷，抑制劑組與其他劑量組比較p-Akt/Akt比值下降(P＜0.05)，見圖 1、表2。

梔子苷對各組大鼠NF-κB表達的影響：與模型組比較，應用梔子苷預處理的大鼠肺組織NF-κB表達降低。應用了PI3K/Akt信號通路抑制劑后再給予藥物梔子苷，抑制劑組與中、高劑量組比較NF-κB表達增強，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖2、表3。

討 論

LIRI在臨床廣泛存在，在治療終末期肺病時，肺移植手術已成為唯一有效手段，因此，如何減輕肺缺血再灌注損傷一直是國內外研究的重點。LIRI是急性無菌性肺損傷的一種形式，具有較高的發病率和病死率。開發研究新藥并探討其作用機制，從而采取有效的臨床干預路徑，減輕LIRI，可有效改善患者的預后，減輕患者的負擔并提高近期及遠期生存率。

表1 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較(x±s，pg/mL)

圖1 梔子苷對各組大鼠p-Akt表達的影響注：A為假手術組；B為模型組；C為梔子苷低劑量組；D為梔子苷中劑量組；E為梔子苷高劑量組；F為LY294002+梔子苷高劑量組。

圖2 梔子苷對各組大鼠NF-κB表達的影響注：A為假手術組；B為模型組；C為梔子苷低劑量組；D為梔子苷中劑量組；E為梔子苷高劑量組；F為LY294002+梔子苷高劑量組。

近年來，通過對LIRI的深入研究，發現炎性反應是LIRI后肺組織繼發損傷的主要機制之一，其中包括轉錄因子的激活和下游炎性因子的釋放。在眾多涉及炎性反應的信號通路中，炎癥級聯反應的早期使動環節被認為是炎性轉錄因子NF-κB的激活及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放。NF-κB活化后，介導TNF-α、IL-1β、IL-6以及其他炎性介質的表達，引起相應炎性介質的合成和釋放，趨化和激活白細胞，導致缺血再灌注損傷的炎性損傷反應[5]。在損傷過程中，PI3K/Akt信號通路的保護作用尤為關鍵。梁俊清等[6]的研究結果表明，PI3K/Akt介導了血管內皮細胞缺氧損傷，可促進抗凋亡因子并抑制促凋亡因子的表達，提高缺氧細胞的增殖率，PI3K/Akt信號通路參與右美托咪定減輕大鼠腦和腎缺血再灌注損傷的過程[7，8]。Akt是PI3K/Akt通路的中心環節，PI3K通過PKD磷酸化Akt使其激活并發揮生物學效應。NF-κB是PI3K/Akt下游的關鍵的轉錄因子。LIRI的病理生理過程中，各種炎性因子、效應細胞、效應因子構成復雜的網絡，NF-κB則是這個網絡的“焦點”，NF-κB能在上游調控炎癥，并成為LIRI時炎癥調節的樞紐[9，10]。有研究表明，加入了NF-κB抑制劑后，通過阻斷I-κB磷酸化的上游信號而抑制NF-κB的活化，從而減輕了LIRI[11]。

表2 各組大鼠肺組織中p-Akt/Akt%比較(x±s)

表3 各組大鼠肺組織中NF-κB/β-actin%比較(x±s)

梔子苷是從傳統中藥梔子中提取的環烯醚萜苷類化合物，研究發現梔子苷對于心、腦、腎等器官的IRI具有明顯的保護作用[12-14]。本研究進一步探索了梔子苷對于肺缺血再灌注的保護作用及機制。研究結果顯示，與模型組(B)比較，梔子苷低劑量(C)、梔子苷中劑量(D)、梔子苷高劑量(E)給藥組大鼠的肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6釋放顯著減少，p-Akt/Akt比值增加，NF-κB表達降低。而應用了PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，與各劑量組比較，TNF-α、IL-1β、IL-6釋放顯著增加，p-Akt/Akt比值降低，與梔子苷中、高劑量組比較，NF-κB表達增高，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

因此，梔子苷對于肺缺血再灌注引起的損傷有保護作用，其保護的機制與提高Akt磷酸化水平、激活PI3K/Akt信號通路、降低NF-κB的表達有關。