知黃潰瘍合劑對口腔潰瘍模型大鼠的藥效學(xué)研究*

唐志立 ，彭賢東 △，王婭俐 ，王 丹 ，譚正懷 ，張仕瑾 ，胡曉燕 ，張 燕 ，郭廷東

（1.四川省南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，四川 南充 637000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（RAU）又稱復(fù)發(fā)性阿弗他口炎、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、復(fù)發(fā)性口瘡，專指一類原因不明、具有周期性反復(fù)發(fā)作但又有自限性的口腔黏膜潰瘍性損害，患病率高達(dá)10% ～20%，居口腔黏膜病首位[1]。中醫(yī)治療主要有內(nèi)服牛黃解毒丸、外用青茶散等，有一定效果，但其存在治標(biāo)不治本、治療時(shí)間長和相當(dāng)部分人群不適的問題。知黃潰瘍合劑原方出自《辨證錄》引火湯，根據(jù)中醫(yī)藥理論對原方進(jìn)行加減，作為醫(yī)院臨床常用經(jīng)驗(yàn)方，由熟地黃、黃柏、知母、玄參等組方，具有補(bǔ)腎水、瀉火解毒、滋陰降火等功效，治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍有良好的療效。但由于原方為傳統(tǒng)湯劑，不方便服用和攜帶，本課題組前期采用現(xiàn)代制劑技術(shù)制成了中藥新制劑知黃潰瘍合劑。本研究中進(jìn)一步評價(jià)知黃潰瘍合劑對大鼠口腔潰瘍的治療作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

動(dòng)物：SPF級SD大鼠，雌性，體質(zhì)量180～220 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(川)2013－19。四川省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理毒理研究所SPF屏障系統(tǒng)，室內(nèi)溫度20～22℃，相對濕度40%～70%，12 h明暗交替照明，合格證號(hào)為 SYXK（川）2013－100，自由飲水。標(biāo)準(zhǔn)飼料由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

儀器：JA1003A型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；JY10001型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；CX21FS1C型生物顯微鏡（奧林巴斯＜廣州＞工業(yè)有限公司）。

試藥：知黃潰瘍合劑為黑褐色液體(每1 mL相當(dāng)于1.5 g原生藥，批號(hào)為 170323，四川省南充市中心醫(yī)院)，本試驗(yàn)劑量按每1 kg體質(zhì)量原生藥1 g計(jì)算；桂林西瓜霜（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為161205，規(guī)格為每片 3.5 g）；冰醋酸（AR，成都長聯(lián)化工試劑有限公司，批號(hào)為20130728，規(guī)格為每瓶500 mL，含量為99.5%），臨用時(shí)用氯化鈉注射液配成20%醋酸溶液；水合氯醛（AR，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)為2016020101，規(guī)格為每瓶 250 g）；0.9% 氯化鈉注射液（昆明南疆制藥有限公司，批號(hào)為C160210D，規(guī)格為每瓶 500 mL）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立[2]

取SD大鼠60只，實(shí)驗(yàn)前置室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境7 d，室溫20～22℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。于造模前24 h禁食，正常飲水，次日將大鼠用水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉，于大鼠口腔右側(cè)頰部黏膜下注射20%醋酸，每只0.05 mL，正常對照組大鼠注射等量0.9%氯化鈉注射液，24 h后即可形成口腔潰瘍。

1.2.2 試驗(yàn)分組及給藥

造模第2天（24 h后）除正常對照組外，將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為5組，即模型對照組、陽性對照組（桂林西瓜霜200 mg／kg）及知黃潰瘍合劑高、中、低劑量組（16，8，4 g 原生藥 ／kg）。知黃潰瘍合劑灌胃給藥（留約0.5 mL藥液緩慢注入大鼠口腔，使藥液與潰瘍面充分接觸）；桂林西瓜霜直接取藥粉，給藥時(shí)將藥粉（大鼠劑量的1／4）均勻涂于潰瘍面上，剩余藥粉（大鼠劑量的3 ／4）以 0.5% 羧甲基纖維素鈉（CMC － Na）溶液制備成混懸液后灌胃。模型對照組和正常對照組分別灌胃等量0.5%CMC－Na溶液，每天 2次，連續(xù) 5 d，末次給藥后1 h處死動(dòng)物，肉眼觀察潰瘍表面愈合情況并分級；取潰瘍處口腔黏膜用甲醛固定，做HE染色觀察。

1.2.3 評級指標(biāo)

潰瘍表面愈合情況分級：0級，肉眼觀察潰瘍恢復(fù)至正常狀態(tài)；Ⅰ級，表面無明顯假膜；Ⅱ級，潰瘍表面有薄層黃白色假膜，周圍無水腫；Ⅲ級，潰瘍表面假膜較厚，且周圍伴有炎性水腫[3]。

病理組織學(xué)檢查：大鼠使用20%醋酸制作口腔黏膜潰瘍模型，知黃潰瘍合劑灌胃，每天2次，連續(xù)5 d后，取潰瘍部黏膜組織，經(jīng)10%福爾馬林充分固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成3～5 μm病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠口腔黏膜結(jié)構(gòu)，口腔潰瘍組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4－5]，結(jié)合本研究實(shí)際情況，擬訂診斷標(biāo)準(zhǔn)，詳見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，行 t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對醋酸致大鼠口腔潰瘍愈合級數(shù)的影響

經(jīng)肉眼評價(jià)各組動(dòng)物潰瘍愈合級數(shù)，陽性對照組（桂林西瓜霜200 mg／kg）與知黃潰瘍合劑中劑量組潰瘍愈合程度顯著提高，與模型對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；知黃潰瘍合劑高劑量組大鼠口腔黏膜潰瘍恢復(fù)情況較模型對照組有一定改善，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。詳見表 2。

表1 口腔黏膜潰瘍組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)

表2 各組大鼠口腔潰瘍愈合級數(shù)比較

2.2 大鼠口腔黏膜潰瘍部位組織學(xué)分級

結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠病理組織學(xué)分級比較

2.3 對大鼠口腔潰瘍模型病理組織的影響

由圖1可見，正常對照組大鼠口腔黏膜上皮完整，間質(zhì)偶見淋巴細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)清晰，未見組織壞死及增生等情況；模型對照組大鼠口腔黏膜上皮可見大片缺損，潰瘍大且深，大量組織壞死、炎性細(xì)胞浸潤，壞死區(qū)域周邊少量新生肉芽組織；陽性對照組及知黃潰瘍合劑中劑量組大鼠口腔黏膜上皮缺損及潰瘍范圍縮小，壞死組織及炎性細(xì)胞浸潤較少，壞死區(qū)域較多新生肉芽組織填充，潰瘍恢復(fù)情況與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠口腔黏膜潰瘍恢復(fù)情況較模型組大鼠有一定改善，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低劑量組大鼠口腔黏膜潰瘍恢復(fù)情況較差，與模型對照組大鼠損傷程度相當(dāng)（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠口腔潰瘍模型病理組織學(xué)檢查結(jié)果（×40）

3 討論

RAU的主要特征是標(biāo)實(shí)本虛，熱壅陰傷，即火熱內(nèi)盛，上攻口舌，熱壅血滯、瘀熱互結(jié)是RAU的重要病理因素，根據(jù)中醫(yī)辨證分為心脾積熱型、陰虛火旺型、氣血虧虛型[6]。目前，RAU的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚，故尚無特效療法。對于重型RAU，多采用局部注射腎上腺皮質(zhì)激素治療，療效顯著，但該方法易造成局部周圍組織的損傷，患者對局部注射激素具有恐懼感，易產(chǎn)生心理負(fù)擔(dān)，遠(yuǎn)程患者復(fù)診困難，應(yīng)用受局限[7]。采用中草藥及其方劑治療復(fù)發(fā)性口瘡，主要是通過改善微循環(huán)、補(bǔ)充微量元素或調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而達(dá)到治療目的。此外，臨床應(yīng)用中成藥與中西醫(yī)結(jié)合治療復(fù)發(fā)性口瘡，如口服中成藥牛黃解毒丸，外用藥物青茶散[8－10]。但以上療法均存在治標(biāo)不治本、治療時(shí)間長和相當(dāng)部分人群不適的缺陷。

知黃潰瘍合劑原方出自《辨證錄》引火湯，原方由熟地、麥冬、巴戟天、茯苓、五味子組方。重用熟地以滋水填精為君；麥冬、五味子滋養(yǎng)肺金，金水相生，以助熟地滋水為臣，其中五味子酸斂，使即補(bǔ)之陰而固封；茯苓補(bǔ)土以制水；巴戟天水火并補(bǔ)，水火既濟(jì)，水下趨，火不得不隨，有引火歸原之功，功同桂附。該方原用于咽喉腫痛屬陰蛾者，現(xiàn)代臨床加減后將其應(yīng)用于干燥綜合征、原發(fā)性三叉神經(jīng)痛、盜汗等疾病。經(jīng)加減后作為臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要由熟地黃和黃柏、知母、玄參等中藥材組方，具有補(bǔ)腎水、瀉火解毒、滋陰降火等功效，治療RAU有良好療效。

黃柏為常用中藥，商品藥材為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid的干燥樹皮，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，臨床用于濕熱瀉痢、黃疸尿赤、帶下陰癢、熱淋澀痛、腳氣痿 、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒，濕疹濕瘡。鹽黃柏滋陰降火，用于陰虛火旺、盜汗骨蒸等癥[11]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，口腔潰瘍的基本病理過程是炎性反應(yīng)，細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白細(xì)胞介素(IL)等發(fā)揮重要作用。在炎性反應(yīng)中，其中TNF－α主要由單核巨噬細(xì)胞合成、分泌，同時(shí)又以自分泌和旁分泌的方式激活其他細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，使其產(chǎn)生并釋放大量IL －1、IL －6、IL －8、前列腺素 E2（PGE2）等炎性介質(zhì)，激發(fā)炎癥的連鎖反應(yīng)，加重機(jī)體損傷，在炎性反應(yīng)中起核心作用。黃柏主要成分為生物堿，對TNF－α的產(chǎn)生有一定抑制作用，從而減輕了炎癥損傷，這可能是黃柏治療口腔潰瘍的作用機(jī)制[12]。

綜上所述，知黃潰瘍合劑對大鼠口腔潰瘍均有治療作用，可以防治口腔潰瘍。經(jīng)組織學(xué)檢查，知黃潰瘍合劑(每1 kg體質(zhì)量8 g原生藥)對20%醋酸制作的口腔黏膜潰瘍模型有較好的療效。