F 2∶3 家系法鑒定大白菜TuMV分離群體單株抗性

滿衛萍 張志剛 李春民 趙智中 王榮花 劉栓桃 李巧云 王立華

摘要：為篩選與目的基因連鎖更加準確的分子標記以及明確分子標記鑒定技術的準確率，同時為后期進行基因精細定位研究提供技術手段，本試驗采用F?2∶3?家系進行F2單株的TuMV抗性鑒定。結果表明，122個大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F?2∶3?家系中，抗病的有98個，感病的有24個，經卡方測驗，符合3∶1的分離比例，與以往對該群體F2代TuMV抗性分離比例的研究一致，表明這種鑒定方法可行。本結果可為今后分離群體單株TuMV抗性的準確鑒定提供參考。

關鍵詞：大白菜;F?2∶3?家系; TuMV;單株抗性

中圖分類號：S634.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）01-0115-04

Identification of Single Plant Resistance to TuMV in Segregated

Population of Chinese Cabbage by F?2∶3Family Method

Man Weiping?Zhang Zhigang2*?， Li Chunmin?3， Zhao Zhizhong?2，

Wang Ronghua?2， Liu Shuantao?2， Li Qiaoyun?Wang Lihua?2

（1.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China;

2. Vegetables and Flowers Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Branch of National Center

for Vegetables Improvement/Shandong Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables， Jinan 250100， China;

3.Penglai Daliuhang Comprehensive Agricultural Service Station， Penglai 265615， China）

Abstract?In order to screen out molecular markers with more accurate linkage distance and make clear of the identification accuracy of molecular markers， as well as for fine gene mapping in the later period， the F?2∶3families were used to identify the TuMV resistance of F2 single plant. The results showed that in 122 Chinese cabbage F?2∶3families with their resistant parent ‘8407 and susceptible parent ‘Guan 291， 98 were resistant families and 24 were susceptible families，which was in accordance with the 3∶1 separation ratio byChi-?square test. This was consistent with previous studies in segregation ratio of TuMV resistance in F2 generation， which indicated that this method was feasible. This study provided a methodological guide for accurate identification of individual isolate on TuMV resistance in the future.

Keywords?Chinese cabbage;F?2∶3Families;TuMV;Single plant resistance

利用分子標記和性狀遺傳分析對F?2?分離群體單株相關性狀進行抗性鑒定并保證鑒定的準確性非常重要。但此類鑒定常常由于環境和操作方法等原因，難以得到準確結果。目前，為獲得準確的鑒定結果，科研中較為常用的鑒定方式是構建F?2∶3?家系研究某一F?2?單株的F?2∶3?家系的性狀表現。

利用F?2∶3?家系開展性狀鑒定的研究已有報道。魏蒙關[1]利用F?2∶3?家系對13個玉米秸稈產量和品質性狀進行單個性狀的QTL定位和效應分析。余學杰等[2]利用 F?2∶3?群體分析玉米的穗長、禿尖長、穗粗、穗行數、行粒數、粒深、百粒重、出籽率和單株生產力等 9 個性狀的變異及其相關性。李清超等[3]利用F?2∶3?群體對玉米株型性狀進行研究，采用灰色關聯度分析法對影響玉米葉向值的主要株型性狀進行分析。周坤華等[4]利用辣椒種間F?2∶3?群體進行主要農藝性狀 QTL 分析，株高、主莖高、果長、果徑、單果質量、果形和果實辣味等7個性狀的9 個加性 QTL 在兩個群體中同時被檢出。魏良明等[5]利用 F?2∶3?家系對玉米淀粉含量的表現及其與單株產量、百粒重、穗長、穗粗、穗行數等的相關性進行了研究。在抗病性鑒定方面，蔣思霞等[6]利用 F?2∶3?家系進行黃曲霉菌抗性鑒定的研究。錢偉[7]在對大白菜TuMV抗性基因retr02進行定位和克隆研究時，也采用F?2∶3?家系輔助F?2?群體單株的TuMV抗性鑒定。李巧云等[8]在研究大白菜抗TuMV分子標記輔助選擇技術時，也引入F?2∶3?家系鑒定，以獲得更準確的原 F?2?單株的TuMV抗性及基因型。目前，尚未見關于利用 F?2∶3?家系鑒定大白菜TuMV分離群體單株抗性具體方法的報道。

本研究通過構建大白菜抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291 的 F?2∶3?家系，對每個 F?2∶3?家系的TuMV抗性進行鑒定，進而判斷原 F?2?代單株的TuMV抗性，推測其基因型，并結合以往關于原F?2?群體的分離比例的研究，進一步驗證這種鑒定方法的準確性。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試抗病親本材料為大白菜TuMV國家級抗源材料8407（P1），感病親本材料為高感TuMV的核心種質材料冠291（P2），兩親本雜交得F?1?群體，F?1?自交后構建F?2?代分離群體，F?2?代單株自交構建F?2∶3?家系。

供試TuMV的C4株系引自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。

1.2?試驗方法

對28株抗病親本8407（P1）、29株感病親本冠291（P2）、30株F?1?和288株F?2?群體分別采用摩擦接種?[9]和剝葉接種相結合的方法接種TuMV的C4株系，共剝葉接種2次，具體參見文獻[10]的方法。接種3周后進行TuMV抗性調查，共調查3次，分別間隔1周。

對F?2?代122個單株自交構建F?2∶3?家系，每個F?2∶3?家系的10株以上單株接種TuMV的C4株系，采用生物學觀察方法對F?2∶3?家系的TuMV抗性進行鑒定。

1.3?抗病性鑒定

病情分級、病情指數計算和抗性歸類標準參見張曉亮[11]的方法和GB/T 19557.5-2004[12]。具體分級標準如下：

0級：無任何癥狀;

0.1級：接種葉出現個別褪綠斑;

0.5級：接種葉出現少數褪綠斑;

1級：心葉明脈，輕花葉;

3級：心葉及中部葉片花葉或心葉皺縮成畸形;

5級：心葉及中、外部葉片花葉，少數病葉畸形、皺縮，植株輕度矮化;

7級：重花葉，多數病葉畸形、皺縮，球葉上出現壞死斑及葉脈輕度壞死，植株矮化;

9級：植株表現嚴重花葉和皺縮，多數葉片畸形，葉脈壞死至整株壞死，無商品價值。

R：0<DS≤1;

MR：1<DS≤3;

MS：3<DS≤5;

S：5<DS≤9。

其中，R表示抗病，MR表示中抗，MS表示中感，S表示感病，DS表示病級，下同。

根據調查結果，計算群體的病情指數：

病情指數=Σ （病級的代表值×該病發病株數）/（調查總株數×最高級代表值）×100?。

高抗（HR）：病情指數0.01～11.11;

抗病（R）：病情指數11.12～33.33;

耐病（T）：病情指數33.34～55.55;

感病（S）：病情指數55.56～77.77;

高感（HS）：病情指數77.78～100。

2?結果與分析

2.1?P1、P2、F?1?及F?2?代群體TuMV抗性分析

由表1可知，抗病親本（P1）各單株病級均在1級以下，其中以0級最多，病情指數為1.43，屬于高抗;感病親本（P2）各單株病級均在5級以上，其中以7級最多，病情指數為77.78，屬于高感;F?1?群體各單株病級均在3級以下，其中以1級最多，病情指數為11.22，屬于抗病;F?2?群體出現抗、感分離，符合3∶1的分離比例（χ?2?c?=1.50<χ?2?0.05?=3.84）。進一步表明本研究中的TuMV抗性受顯性單基因控制。

2.2?F?2∶3?家系TuMV抗性分析

由表2可以看出，根據122個F?2∶3?家系的病情指數推測原F?2?單株的TuMV抗性，結果為：高抗（HR）48株，抗病（R）33株，耐病（T）17株，感病（S）21株，高感（HS）3株;抗、感單株比為98∶24，符合3∶1的分離比例（χ?2c=1.85<χ?2?0.05?=3.84）。

根據抗病性鑒定特點，抗病株系中沒有出現感病單株，表明其抗性是純合的（參考病情指數為?0.01～?2.00），基因型記為AA;抗病株系中出現感病單株，表明其抗性不是純合的（參考病情指數為?2.01～?55.55），基因型記為Aa;感病株系在接種時，由于接種手法、環境等因素的影響，不能保證所有單株都發病，因此，病情指數55.56～100的全部歸為純合感病，基因型記為aa。

由表3看出，122個F?2?單株中，基因型為AA的有30株，基因型為Aa的有68株，基因型為aa的有24株。基因型AA∶Aa∶aa的比例為30∶68∶24，符合1∶2∶1的分離比例（χ?2c=2.20<χ?2?0.05?=?5.99）。

3?討論與結論

在分子標記與基因定位研究中，表型鑒定的準確性直接影響到分子標記的遺傳距離計算和基因定位的準確性。因此，研究更加準確的分離群體單株性狀鑒定方法尤為重要。

本研究利用抗TuMV材料 8407和感病材料冠 291為親本，構建122個F?2∶3?家系，通過對這些家系進行TuMV接種和鑒定，判斷原F?2?單株的TuMV抗性。結果表明，抗病株系有98個，感病株系有24個，經卡方測驗，符合3∶1的分離比例。這一結果與以往對該群體F?2?代TuMV抗性分離比例的研究結果一致[11]，表明這種鑒定方法可用于大白菜TuMV抗性單株鑒定。相對于F?2?代單株接種鑒定方法，此方法根據F?2∶3?家系的病情指數來判斷原F?2?單株的抗性，準確性更高。

本課題組在2009年發表過一篇關于ELISA方法鑒定分離群體單株抗性的研究[9]。但該方法仍未能排除接種手法和環境對單株抗性的影響。相比較而言F?2：3?家系的性狀表現整體情況更能反映原F?2?單株的真實性狀特點。在大白菜分子標記輔助選擇方面，錢偉[7]采用了F?2∶3?家系輔助F?2?群體單株的TuMV抗性鑒定，用于大白菜TuMV抗性基因retr02的精細定位研究，獲得準確的精細定位結果，并進行了相關基因的克隆。本課題組[8]在研究大白菜抗TuMV分子標記輔助選擇技術時，也引入F?2∶3?家系鑒定，獲得了較為準確的標記選擇準確率。本研究所得利用F?2∶3?家系輔助F?2?群體進行TuMV抗性鑒定的方法可為今后更好地從事相關方面的研究提供參考。

參?考?文?獻：

[1]魏蒙關.玉米兩個相關F?2∶3?群體秸稈產量和品質性狀QTL分析及遺傳相關研究[D].鄭州：河南農業大學，2009.

[2]余學杰，石海春，柯永培，等. 一個玉米F?2∶3?群體主要性狀的變異及相關分析[J]. 玉米科學，2008 ，16（3）： 22-25.

[3]李清超，馬浪浪，文瓊，等. 基于玉米F?2∶3?群體株型性狀的灰色關聯度分析[J]. 廣東農業科學，2015，42（21）：6-10.

[4]周坤華，雷剛，方榮，等. 利用辣椒種間 F?2和F?2∶3?兩個群體進行其主要農藝性狀 QTL 分析[J]. 園藝學報，2015，42（5）：879-889.

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[6]蔣思霞，陳堅劍，徐志英，等. 玉米自交系和F?2∶3?家系對黃曲霉菌抗性的鑒定[J]. 揚州大學學報（農業與生命科學版），2012，33（2）：45-50.

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[8]李巧云，張志剛，趙智中，等. 大白菜抗TuMV分子標記輔助選擇技術研究[J].山東農業科學，2017，49（2）： 10-14.

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[12]國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. 植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 大白菜：GB/T 19557.5—2004 [S].北京：中國標準出版社，2004.