p53基因3′UTR雙熒光素酶報告質粒的構建及其與miRNA-2127靶向關系的驗證

張玉霞 袁小遠 王友令 孟凱

摘要：為了驗證miRNA-2127與p53基因的靶向關系，利用生物信息學軟件預測p53與miRNA-2127的結合位點，全基因合成法合成該結合位點的野生型與突變型模板，并將其克隆到pmiR-RB-REPORT??TM?雙熒光素酶報告載體中，構建野生型與突變型重組雙熒光素酶報告質粒。將293T細胞分為4組，分別共轉染野生型報告質粒+陰性對照（NC）、野生型報告質粒+miRNA-2127、突變型報告質粒+NC、突變型報告質粒+miRNA-2127。檢測各組細胞中熒光素酶活性差異，結果顯示：共轉染了野生型報告質粒+miRNA-2127的293T細胞與共轉染了野生型報告質粒+NC組相比，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）;且突變型報告質?粒+?miRNA-2127組的相對熒光素酶活性顯著高于野生型報告質?粒+??miRNA-?2127（P<0.05），說明?miRNA-?2127能夠靶向調控p53基因，且結合位點位于3′UTR區(qū)369—375間。

關鍵詞：p53;miRNA-2127;雙熒光素酶報告系統

中圖分類號：S813.10??文獻標識號：A??文章編號：1001-4942（2019）01-0001-04

Construction of Dual-Luciferase Reporter

Plasmids by ?3′UTR Region of p53 Gene and

Their Targeted Relationship with miRNA-2127

Zhang Yuxia， Yuan Xiaoyuan， Wang Youling， Meng Kai

（Institute of Poultry Sciences， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250023， China）

Abstract?To verify the targeted relationship between miRNA-2127 and p53， the binding sites of p53 and miRNAs-2127 were predicted by bioinformatics software. The wild-type and mutant templates of the binding sites were synthesized by the whole gene synthesis method， and were cloned into pmiR-RB-REPORT??TM??dual-luciferase reporter vector to construct the wild-type and mutant-type recombinant dual-luciferase reporter plasmids. The cultured monolayer 293T cells were divided into 4 groups including co-transfected wild-type reporter plasmid + NC control， co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127， ?co-?transfected mutant reporter plasmid + NC control and co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127， respectively. The difference of luciferase activity in each group was detected. The results showed that compared with co-transfected wild-type plasmid + NC control， the relative luciferase activity of 293T cells in the group with co-transfected wild-type plasmid + miRNA-2127 showed a significant decrease （P<0.05）， and that of co-transfected mutant reporter plasmid + miRNA-2127 group was significantly higher than co-transfected wild-type reporter plasmid + miRNA-2127 group. The results indicated that miRNA-2127 could targeted regulate p53 and the binding sites were located between 369 and 375 in the 3′ UTR region.

Keywords?p53; miRNA-2127; Dual-luciferase reporter system

p53蛋白是一種細胞核磷酸蛋白，能調控細胞生長與基因轉錄，被認為是一種在許多細胞進程中起到關鍵調控作用的因子。近年來的研究發(fā)現，p53蛋白除了具有腫瘤抑制功能外，其在機體抗病毒免疫反應中也起著重要作用[1]。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小RNA分子，長度約19～25 nt，普遍存在于真核細胞內，在進化過程中高度保守，其在細胞增殖、凋亡、應激應答及新陳代謝等多項生理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，miRNA調控著p53基因的表達[2]。Le等[3]將斑馬魚腦組織中的miR-125b敲除以后發(fā)現p53蛋白水平明顯上調，miR-125b是p53的負調控因子，miR-125b通過直接作用于p53的3′UTR區(qū)在轉錄水平上調控p53的表達，并誘導細胞凋亡過程。之后，又有研究陸續(xù)證實miR-1285、miR-125a、miR-33和miR-504[4]均可直接作用于p53的3′UTR 區(qū)，從而在轉錄水平上負調控p53蛋白的表達。

本研究通過生物學信息方法預測p53基因與miRNA-2127的靶向關系，并試圖通過雙熒光素酶報告試驗來驗證二者的靶向關系，以為后續(xù)研究工作奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

pmiR-RB-REPORT??TM?雙熒光素酶報告載體及檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司;人腎上皮細胞293T細胞系購自ATCC公司;DH5α感受態(tài)本實驗室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清均為Gibico產品;Lipofectamine??TM??3000為天根品牌。

TIAN prep Mini Plasmid Kit質粒小提試劑盒、Universal DNA Purification Kit DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;限制性內切酶（XhoⅠ、NotⅠ）、DNA聚合酶、普通DNA聚合酶購自Thermo公司;蛋白胨、酵母提取物為OXOID公司產品;氨芐青霉素為Sigma產品。

1.2?miRNA-2127與p53基因靶向關系的生物信息學預測

參考miRNA數據庫（http：//www.mirbase.org）利用生物信息學方法（TargetScan、PicTar、miRanda）分析預測p53與miRNA-2127的靶向關系。

1.3?p53基因3′UTR序列擴增與合成

經生物信息學預測，miRNA-2127與p53基因3′UTR區(qū)結合，通過全基因合成方法合成p53 3′UTR區(qū)全基因模板（即野生型），然后通過改變miRNA-2127與3′UTR結合位點（369—375）的氨基酸序列使miRNA-2127不能與p53的3′UTR區(qū)結合（即突變型）。野生型與突變型均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4?雙熒光素酶報告載體構建及轉化

用XhoⅠ、NotⅠ分別對p53野生型與突變型基因模板以及pmiR-RB-REPORT??TM?載體進行雙酶切。酶切反應體系如下：10×H緩沖液4 μL，DNA約2 μg，內切酶（10 U/μL）各1 μL，滅菌去離子水補足到40 μL，置37℃作用4 h。酶切后按照純化試劑盒說明書進行純化回收。

取回收的目的片段DNA 2 μL（約150 ng），載體0.5 μL（約50 ng），solution I快速連接液5 μL， 滅菌去離子水補足到10 μL，16℃連接30 min。取連接產物加到100 μL DH5α感受態(tài)細胞中混勻，冰浴30 min。將上述轉化液置于42℃水浴90 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min。向其中加入900 μL 37℃預熱的LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)45 min。2 500 r/min離心5 min，棄上清，留100 μL混勻菌液，置于含Amp抗生素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～16 h。

1.5?PCR鑒定及測序

挑取上述平板上的單菌落，溶入3 μL水中，取0.5 μL做模板，進行PCR鑒定。采用10 μL反應體系：10×Taq buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 5 μL，載體上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶?（2.5??U/μL）0.3 μL，DNA模板0.5 μL（約100 ng），用滅菌水補足10 μL體系。反應條件為：95℃預變性3 min;循環(huán)內95℃變性30 s，56℃退火，72℃延伸1 min，20個循環(huán);PCR反應循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸3 min。結束后，取5 μL PCR產物進行?1.5%?瓊脂糖電泳分析。

回收PCR產物，將其連接至pGEM-T Easy Vector載體中，轉化至感受態(tài)DH5α，均勻涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板中常規(guī)培養(yǎng)。16 h作用挑取白色菌落擴增培養(yǎng)，提取質粒進行PCR鑒定，將鑒定合格菌液送華大基因公司一代測序法測序。

1.6?細胞培養(yǎng)及轉染

取對數生長期的293T細胞，以每孔1.5×10?4個細胞接種于96孔板中，每孔總體積100 μL，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。選用對數生長期細胞，試驗共分4組：A組為共轉染陰性對照?（non-?target control，NC）和野生型報告質粒組;B組為共轉染miR-2127和野生型報告質粒組;C組為共轉染陰性對照與突變型報告質粒組;D組為共轉染miR-2127與突變型報告質粒組。取2 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-2127或陰性對照NC，3 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋靶基因野生型或突變型報告質粒，5 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋0.225 μL Lipofectamine??TM??3000試劑，三者混合，共10 μL，輕輕搖勻，靜置15 min。將培養(yǎng)板內的細胞液吸棄，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基，然后加入上述混合液10 μL，最終每孔總體積100 μL。其中miR-2127轉染濃度均為50 nmol/L，質粒濃度為100 ng/孔，每組設3個復孔。于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.7?各組熒光素酶活性檢測

轉染48 h后吸出培養(yǎng)基，以35 μL/孔加入PBS，并加入luciferase底物35 μL/孔，振蕩10 min，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，測定293T細胞中的熒光值。

1.8?統計學處理數據

采用SPSS軟件進行單因素方差分析和t檢驗，比較4組細胞中熒光值的差異。

2?結果與分析

2.1?p53基因野生型及突變型報告質粒的PCR鑒定

隨機挑取突變型和野生型菌落，進行菌液PCR鑒定，擴增的條帶理論大小為636 bp，其實際擴增條帶如圖1所示，與預期片段大小一致。

2.2?p53基因野生型及突變型報告質粒測序結果

由圖2測序結果可見，已成功將靶序列ACTGAAA （369—375）突變?yōu)門GACTTT。

2.3?各組細胞中熒光素酶活性變化

一般條件下，miRNA跟NC對照相比，野生型載體報告熒光有所下調，則認為miRNA對報告基因有調節(jié)作用[5]。由圖3可見，miRNA-2127+野生型報告質粒組293T細胞中的相對熒光素酶活性較NC+野生型報告質粒組顯著降低（P<?0.05），?證明miRNA-2127能有效抑制野生型質粒熒光素酶的活性;miRNA-2127+突變質粒報告組293T細胞中的相對熒光素酶活性顯著高于miRNA-?2127+?野生型質粒報告組（P<0.05）。證明miRNA-2127質粒無法抑制突變型熒光素酶活性。因此表明miRNA-2127與預測到的p53基因3′UTR位點有明顯的相互作用。

3?討論與結論

p53基因是迄今為止已發(fā)現與腫瘤發(fā)生相關性最高的基因，野生型p53基因通過調控細胞周期內的增殖、分化和凋亡來維持生物機體內基因組和細胞的穩(wěn)定，可抑制腫瘤生長，而突變型p53基因則能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，誘導原位癌的形成，該突變位點可應用于腫瘤的早期診斷[6]。p53蛋白除了作為熱門的腫瘤抑制蛋白被大量研究之外，還被發(fā)現是宿主天然免疫因子，其對不同種類病毒復制的抑制作用不斷被證實。2003年Takaoka等[7]首次報道p53具有抗水泡性口炎病毒的作用，研究還發(fā)現p53蛋白能夠抑制新城疫病毒[8]、傳染性法氏囊病毒[9]、脊髓灰質炎病毒等的復制。2006年，Voorhoeve等[10]在篩選人miRNA時首次發(fā)現miRNA參與p53信號通路，是p53信號通路調控網絡中的關鍵分子，miRNA通過特異結合mRNA，導致mRNA的降解或翻譯抑制，從而參與調控細胞的生長與凋亡。因此通過挖掘調控p53的miRNA，可為宿主抗擊疾病提供更深層次的解讀，也可為開發(fā)更廣譜的抗腫瘤和病毒的基因藥物奠定基礎。

構建合適的報告載體，對增加或降低p53蛋白含量的miRNA進行篩選非常重要。本研究經PCR和測序鑒定，證實已成功構建p53基因的雙熒光素酶報告表達載體。雙熒光素酶報告檢測系統顯示miRNA-2127+野生型熒光素酶活性較陰性對照+野生型對照明顯降低，提示miRNA-2127可直接作用于p53基因的3′UTR區(qū)，抑制其熒光素活性。這為進一步研究miRNA提供了基礎。

參?考?文?獻：

[1]晏文君， 吳開寶， 馬志永. 腫瘤抑制因子p53功能及其抗病毒作用研究進展[J]. 病毒學報， 2012，28（4）：462-470.

[2]李宇鵬， 張一鳴， 胡海碧，等. 肝癌細胞HepG2中p53調控miRNA-3661的生物信息分析與功能驗證[J]. 生物技術通報， 2017， 33（7）：216-223.

[3]Le M T N， Teh C， Shyh-Chang N， et al. MicroRNA-125b is a novel negative regulator of p53 [J].Genes & Development， 2009， 23（7）： 862-876.

[4]Hermeking H. MicroRNAs in the p53 network： micromanagement of tumour suppression [J].Nature Reviews Cancer， 2012， 12（9）： 613-626.

[5]魏斌， 鄧霞， 卞秀娟，等. AKT2 3′-UTR熒光素酶報告基因載體構建及與miRNA-625靶向關系驗證[J]. 江蘇大學學報（醫(yī)學版），2016， 26（3）：204-207.

[6]賈春平. 抑癌基因p53與腫瘤研究的最新進展[J]. 生命科學， 2008， 20（3）：450-453.

[7]Takaoka A， Hayakawa S， Yanai H， et al. Integration of interferon-α/β signalling to p53 responses in tumour suppression and antiviral defence [J]. Nature， 2003， 424（6948）： 516-523.

[8]Fábián Z， Csatary C M， Szeberényi J， et al. p53-independent endoplasmic reticulum stress-mediated cytotoxicity of a Newcastle disease virus strain in tumor cell lines [J]. Journal of ?Virology，2007， 81（6）： 2817-2830.

[9]歐陽偉， 王永山， 王永強，等. 傳染性法氏囊病病毒感染細胞內源性microRNA表達差異分析[J]. 中國獸醫(yī)學報， 2012， 32（3）：329-336.

[10]Voorhoeve P M， le Sage C， Schrier M，et al. A genetic screen implicates miRNA-372 and miR-373 as on cogenes in testicular germ cell tumors[J]. Cell， 2006， 124（6）：1169-1181.