VGX-1027抑制PM2.5介導的小鼠肺部炎癥和氣道高反應

徐蒙蒙，韓曉燕，李 鋒，王沐昀，張 海，陳宇清，張妍蓓

(1. 安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干部呼吸與危重癥醫(yī)學科，安徽 合肥 230022；2. 上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院呼吸科，上海 200080；3. 上海交通大學附屬胸科醫(yī)院呼吸科，上海 200030)

隨著工業(yè)化和城市化的迅速發(fā)展，空氣污染日益加劇，細顆粒物(fine particulate matters， PM2.5)作為最主要的空氣污染物，嚴重威脅著人類健康。流行病學調查表明，空氣中PM2.5濃度的升高與咳嗽、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等呼吸系統疾病的發(fā)病及癥狀加重密切相關[1]。PM2.5(空氣動力學粒徑<2.5 μm)極易隨呼吸進入肺部，并沉積于遠端小氣道和肺泡，刺激肺泡上皮和肺部微循環(huán)，可誘導氣道平滑肌收縮和肺部炎癥。最近的研究證實，PM2.5的鼻腔滴入能夠引起小鼠肺部炎癥和氣道高反應[2]。

VGX-1027[(S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxasole acetic acid]，分子量為205.21，化學式為C11H11NO3，其結構式見Fig 1[3]。VGX-1027是一種異惡唑化合物，不溶于水，易溶于乙醇和二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。作為一種免疫調節(jié)劑，VGX-1027主要通過調控Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路，發(fā)揮抗炎作用，同時也抑制TNF-α的產生[3]。最近的研究表明，VGX-1027通過抑制TLR4/NF-κB信號路徑，抑制脂多糖引起的腎臟損傷[4]。而PM2.5在引起肺部炎癥反應的同時，也伴隨著TLR4/NF-κB路徑的活化，同時釋放大量的炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)[5]。本研究旨在探究VGX-1027能否在PM2.5介導的肺部炎癥和氣道高反應性模型中發(fā)揮保護作用。

Fig 1 Structure of (S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxasole acetic acid (VGX-1027)

1 材料與方法

1.1實驗動物8～10周齡SPF級C57BL/6小鼠，體質量(22～25) g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016。飼養(yǎng)于上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院動物中心的屏障系統，本研究得到上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會的批準。實驗前適應性喂養(yǎng)1周，正常飲食，循環(huán)光照。

1.2儀器與試劑小動物氣體麻醉機(上海玉研儀器公司)；氣道高反應儀(Forced Maneuvers系統)(英國EMMS公司)；Shandon Cytospin細胞離心機、酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；蛋白印跡自動成像儀(美國Bio-Rad公司)。異氟烷由上海玉研儀器公司提供；劉氏染液，購自珠海貝索生物技術有限公司；VGX-1027(批號：S7515)，購自美國Selleck公司；TNF-α、小鼠CXCL1/KC、IL-1β ELISA試劑盒，均購自杭州聯科生物技術有限公司；NLRP3(批號：15101S)、NF-κB(批號：3033S)、phospho-NF-κB(批號：8242S)、GAPDH(批號：5174S)抗體，均購自美國Cell Signaling公司；caspase-1抗體(批號：ab178515)，購自英國Abcam公司。

1.3大氣PM2.5采樣及處理2017年10月～2018年4月，于上海市非工業(yè)區(qū)，使用嶗應2030型中流量PM2.5采樣器(青島嶗山應用技術研究所)，采用玻璃纖維濾膜(青島嶗山應用技術研究所)采集大氣PM2.5，將采集到顆粒物的濾膜置于去離子水中，使用超聲波清洗器洗脫下來，然后冷凍真空干燥，收集PM2.5，-20 ℃干燥保存。使用前，稱取一定量的PM2.5，用PBS緩沖液配制成PM2.5混懸液，超聲震蕩混勻，4 ℃保存。PM2.5具體成分見Tab 1。

Tab 1 PM2.5 composition analysis

TOC: Total organic carbon.

1.4動物分組與處理48只C57BL/6小鼠隨機分為對照(PBS)組、VGX-1027+PBS組、PM2.5組、低劑量VGX-1027(12.5 mg·kg-1)+PM2.5組、中劑量VGX-1027(25 mg·kg-1)+PM2.5組和高劑量VGX-1027(50 mg·kg-1)+PM2.5組，每組8只。PBS組、PM2.5組的小鼠置于氣體麻醉機密封箱中，以異氟烷麻醉后，經鼻腔注入50 μL的PBS或者PM2.5混懸液，劑量為7.8 mg·kg-1[6]。VGX-1027+PBS組于鼻腔滴入PBS前1 h腹腔注射VGX-1027(50 mg·kg-1)，VGX-1027+PM2.5組于鼻腔滴入PM2.5混懸液前1 h腹腔注射VGX-1027(12.5、25、50 mg·kg-1)，每天1次，連續(xù)2 d。

1.5氣道反應檢測d 3腹腔注射0.15～0.2 mL的1%戊巴比妥鈉后，小鼠氣管切開，插入氣管導管，置入體積描記箱(Forced Maneuvers系統)，并連接電腦控制的呼吸機，給予一定濃度梯度(0、4、8、16、32、64、128、256 mg·L-1)的乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)霧化吸入，檢測小鼠的氣道反應性。

1.6支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF) 腹腔注射0.4 mL的1%戊巴比妥鈉處死小鼠。應用2 mL的PBS進行支氣管肺泡灌洗，回收BALF，并離心，重懸細胞顆粒，計數后，在細胞離心機制片，采用劉氏染液染色。顯微鏡下計數至少500個細胞，并區(qū)分各類炎癥細胞的比例。

1.7組織病理學分析左肺用4%福爾馬林灌注、固定，石蠟包埋，厚4 μm切片，進行HE染色，評估支氣管周圍的肺部炎癥積分。0=無炎癥反應；1=輕度炎癥反應，支氣管壁、血管壁或肺泡間隔有少量炎癥細胞；2=中度炎癥反應，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有成片炎癥；3=重度炎癥反應，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有廣泛的炎癥。

1.8細胞因子檢測使用ELISA試劑盒，按照說明書操作，檢測BALF中炎性細胞因子TNF-α、KC、IL-1β水平。

1.9免疫印跡分析取一定量的小鼠肺組織，以蛋白裂解液研磨，制備10%的組織勻漿液，離心、取上清，蛋白定量、變性?？偟鞍咨蠘恿繛?0 μg，經SDS-PAGE電泳后，轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別用NLRP3、caspase-1、NF-κB、phospho-NF-κB一抗孵育過夜。用對應的 IgG二抗室溫孵育1 h，洗膜后，以ECL發(fā)光液孵育，并置于自動成像儀進行化學發(fā)光檢測。運用 Image J圖像分析軟件測定蛋白灰度值。

2 結果

2.1VGX-1027抑制PM2.5介導的氣道高反應如Fig 2所示，與PBS組相比，PM2.5鼻腔滴入介導明顯的氣道高反應；與PBS組相比，VGX-1027預處理不影響PBS組的氣道反應性。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預處理組對PM2.5引起的氣道高反應無影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預處理組明顯抑制PM2.5介導的氣道高反應。

Fig 2 VGX-1027 prevented PM2.5-induced airway hyperresponsiveness n=8)

Mean percentage increase in lung resistance (RL) to increasing concentrations of acetylcholine (Ach).*P<0.05,**P<0.01vsPBS group;#P<0.05,##P<0.01vsVGX-1027(25 mg·kg-1)+PM2.5group;△P<0.05,△△P<0.01vsVGX-1027(50 mg·kg-1)+PM2.5group.

2.2VGX-1027減少PM2.5介導的BALF炎癥細胞增加Tab 2結果顯示，與PBS組相比，PM2.5組小鼠BALF中的細胞總數、巨噬細胞數、中性粒細胞數、嗜酸性粒細胞數及淋巴細胞數均增高。與PBS組相比，VGX-1027預處理不影響PBS組的BALF中細胞總數與炎癥細胞分類。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1VGX-1027處理后，BALF中炎癥細胞數無明顯變化；25、50 mg·kg-1的VGX-1027處理后，BALF中性粒細胞數、嗜酸性粒細胞數及淋巴細胞數均降低，差異有統計學意義。

2.3VGX-1027減輕PM2.5介導的肺部炎癥肺組織HE染色結果表明，PM2.5組小鼠肺部炎癥細胞浸潤明顯，肺部炎癥積分高于PBS組小鼠。與PBS組相比，VGX-1027預處理不影響PBS組的肺部病理。與PM2.5組小鼠相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預處理組肺部炎癥浸潤影響較弱；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預處理組明顯減弱PM2.5介導的肺部炎癥浸潤(Fig 3A)，且肺部炎癥積分明顯下降(Fig 3B)。

Tab 2 Differential inflammatory cell counting in BALF (×106 n=8)

**P<0.01vsPBS;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5.

Fig 3 Lung pathological features of HE staining (A) and inflammation scores (B) n=8)

1: PBS; 2: VGX-1027+PBS; 3: PM2.5; 4: VGX-1027(12.5 mg·kg-1)+PM2.5; 5: VGX-1027(25 mg·kg-1)+PM2.5; 6: VGX-1027(50 mg·kg-1)+PM2.5.**P<0.01vsPBS group;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5group.

2.4VGX-1027降低PM2.5介導的炎性因子水平升高Tab 3的ELISA結果顯示，PM2.5組小鼠BALF中的炎性因子TNF-α、KC、IL-1β水平明顯升高。與PBS組相比，VGX-1027預處理不影響PBS組的BALF中的炎性因子水平。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預處理組肺部炎癥因子水平無明顯影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預處理組降低PM2.5介導的肺部炎性因子(TNF-α、KC、IL-1β)水平。

2.5VGX-1027抑制PM2.5介導的炎性轉錄因子NF-κB的磷酸化Fig 4的Western blot檢測顯示，與PBS組相比，PM2.5鼻腔滴入引起小鼠肺組織炎癥轉錄因子NF-κB的磷酸化水平升高。與PBS組相比， VGX-1027預處理不影響PBS組的NF-κB的磷酸化水平。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預處理對PM2.5介導的NF-κB的磷酸化水平增高無明顯影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預處理，抑制PM2.5介導的NF-κB的磷酸化水平增高。

2.6VGX-1027抑制PM2.5引起的NLRP3炎性小體的表達和caspase-1的活化Western blot檢測顯示(Fig 4)，與PBS組相比，PM2.5組小鼠肺組織NLRP3炎性小體和凋亡蛋白酶caspase-1的表達增強；VGX-1027預處理不影響PBS組NLRP3和caspase-1的表達。與PM2.5組相比，12.5 mg·kg-1的VGX-1027預處理對PM2.5介導的NLRP3和caspase-1表達無明顯影響；25、50 mg·kg-1的VGX-1027預處理，抑制PM2.5介導的NLRP3和caspase-1的表達。

3 討論

TLR4通路在炎癥過程中發(fā)揮重要的調控作用，主要被細菌內毒素脂多糖所活化，從而誘發(fā)嚴重的炎癥反應。實驗性研究表明，PM2.5暴露能夠引起明顯的氣道高反應和肺部炎癥，同時伴隨著TLR4/NF-κB路徑的活化[2, 5]。因此，通過對TLR4信號的干預，可能會緩解PM2.5引起的肺部炎癥反應。本研究發(fā)現，在PM2.5介導的肺部炎癥和氣道高反應性模型中， VGX-1027(25、50 mg·kg-1)預處理抑制PM2.5介導的肺部炎癥和氣道高反應，同時抑制TLR4下游信號NF-κB的磷酸化，以及NLRP3炎性小體的表達與活化。

Tab 3 Levels of inflammatory factors in BALF (ng·L-1, n=8)

**P<0.01vsPBS;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5

Fig 4 Effects of VGX-1027 on PM2.5-induced lung inflammation determined by Western blot n=8)

*P<0.05,**P<0.01vsPBS group;#P<0.05,##P<0.01vsPM2.5group

在本研究中，PM2.5的急性暴露引起了明顯的氣道高反應。氣道高反應性是指氣管或支氣管對一系列藥理的、化學的、生理的吸入刺激物，產生過分的收縮反應。氣道高反應性是哮喘和COPD的重要特征。有研究表明，中性粒細胞在有機粉塵所引起的肺部炎癥和氣道高反應中具有重要的作用[6]。而TNF-α和KC在募集中性粒細胞的過程中發(fā)揮了重要作用[7]，同時，TNF-α和IL-1β也可能增強氣道平滑肌的收縮，促進氣道高反應的發(fā)生[8]。TLR4信號的活化能夠促進一系列炎性基因的表達，因此，VGX-1027抑制PM2.5引起的氣道高反應的發(fā)生可能是通過阻斷TLR4信號，抑制炎癥基因的表達，從而減輕氣道平滑肌的收縮反應。

吸入性PM2.5黏附于氣道上皮后，可被識別為病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，進而活化TLRs等信號通路，如TLR4，引發(fā)一系列炎性細胞因子的釋放，并募集眾多的炎性白細胞入肺，引發(fā)急性肺部炎癥和免疫紊亂[9-10]。本實驗中，PM2.5的鼻腔滴入介導小鼠肺部炎細胞浸潤，伴隨巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的計數增多。其中，巨噬細胞可以吞噬肺部侵入性顆粒物，并釋放炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)，招募單核細胞和中性粒細胞入肺[11]。同時，巨噬細胞膜表面TLR4信號活化，在髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)的輔助下，促進腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor associated factor-6, TRAF6)的多聚泛素化，驅使炎性轉錄因子NF-κB的磷酸化，引起炎性基因的表達[12]。本研究發(fā)現， PM2.5可引起肺組織炎癥轉錄因子NF-κB的磷酸化水平升高，同時伴有炎性因子(TNF-α、KC、IL-1β)水平明顯升高。VGX-1027能夠明顯下調PM2.5誘導的NF-κB蛋白的磷酸化，降低TNF-α、KC和IL-1β的水平，減輕肺部炎癥浸潤。

此外，黏附于氣道上皮的PM2.5被上皮細胞或巨噬細胞吞噬進入細胞后，導致溶酶體破裂、線粒體受損，進而活化NLRP3炎性小體，激活凋亡蛋白酶caspase-1，導致細胞出現炎癥性死亡——細胞焦亡[13]。另一方面，活化的caspase-1能夠切割IL-1β前體，促進其成熟體的釋放，引起炎癥反應[14-15]。本研究中，VGX-1027預處理抑制PM2.5介導的NLRP3炎性小體的表達增加及caspase-1的活化，同時下調IL-1β的表達。

總之，本研究發(fā)現，VGX-1027能夠減輕PM2.5介導的肺部炎癥和氣道高反應。這種保護性作用可能是由于抑制TLR4/NF-κB信號路徑和NLRP3炎性小體的活化，為VGX-1027作為新型肺部抗炎藥物的開發(fā)與應用提供了實驗證據。

(致謝：本實驗在上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院臨床轉化研究院呼吸科實驗室完成。對所有參與本實驗的研究人員致以誠摯的感謝！)