蛇床子素上調miRNA-9抑制BACE-1表達治療阿爾茨海默病

藺 瑩，姚瓔珈，梁喜才，時 悅，倪穎男，吳雨桐，楊靜嫻

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

阿爾茨海默病( Alzheimer’s disease，AD )是一種發病過程漫長，多發生于中老年人，具有一定遺傳性的神經退行性疾病。主要的臨床表現為記憶力的減退以及認知功能的缺失[1-2]。關于AD的發病機制存在著多種假說，其中β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積學說是當今的研究熱點。β-分泌酶1(β-site APP cleaved enzyme-1,BACE-1)作為Aβ生成的限制酶，促進淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解成Aβ，間接控制著Aβ產生。BACE-1活性增強，Aβ生成增多，易導致Aβ異常聚集，沉積在腦內引起炎癥等反應，造成神經元丟失、腦組織萎縮[3-4]。因此，抑制BACE-1表達，減少Aβ的生成，可以延緩AD的發生。

蛇床子素(osthole,OST)又名甲氧基歐芹酚(C15H16O3)，是傘形科植物獨活中的活性單體[5]。現代藥理學發現，OST具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化應激等[5-7]。中醫中，獨活具有溫腎壯陽、燥濕、祛風、殺蟲等作用。實驗室前期研究發現，OST可以調控miRNA-9，并且對神經系統具有一定的保護作用[8-10]。體內實驗發現，以20 mg·kg-1OST灌胃給予APP/PS1小鼠，對AD有一定的治療作用[11]。

MicroRNAs (miRNAs)是一種調節內源性基因的非編碼小RNA，它主要通過抑制mRNA的翻譯或促進其降解而發揮作用[12]。近年來研究表明，AD的發生與多種miRNAs異常表達相關。現代藥理學研究中，miRNAs可以作為診斷某種疾病的標志，并且miRNAs幾乎可以調控人體內每一個生理過程[13]。本實驗利用基因芯片技術，篩選差異表達的miRNA，并利用生物信息學預測miRNA調控的下游靶基因，探討OST治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與細胞株 9月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠20只，♀♂各半，體質量(26±4)g，購自北京中科澤晟生物技術有限公司[SCXK(京)2013-0002]；SPF級C57BL/6小鼠10只，♀♂各半，體質量(23±3)g，購于遼寧長生生物有限公司[SCXK(遼)：2010-0001]。293T細胞株、人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，均由首都醫科大學提供。

1.1.2試劑 OST，購于中藥食品藥品研究所(批號：110822-200407)；APP595/596質粒、GFP質粒，以及輔助質粒 pLP1、pLP2、pMDG，由天津醫科大學提供；miRNA-9抑制劑，蘇州吉瑪基因股份有限公司產品；BACE-1引物，大連萬澤生物技術有限責任公司產品；兔抗BACE-1、兔抗β-actin抗體，北京博奧森生物技術有限公司產品；DAPI染液，美國Sigma公司產品；Bradford法蛋白濃度試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司產品。

1.1.3儀器 天平(德國賽多利斯艾科勒)；Ti-S型熒光顯微鏡(日本尼康公司)；二氧化碳培養箱(美國Nuaire公司)；MG96G PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司)；水平核酸電泳儀、半干式蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)、MR-96A酶標儀(深圳邁瑞公司)。

1.2方法

1.2.1基因芯片技術篩選差異表達miRNA 取OST16 mg，溶解于2 mL PEG400中，加入ddH2O稀釋至4 mL，4 ℃備用。9月齡APP/PS1小鼠，♀♂各半，將APP/PS1小鼠隨機分為模型組(APP組)和給藥組(OST組)，每組10只；另取C57BL/6小鼠作為空白對照組(Control)。給藥組小鼠以20 mg·kg-1OST灌胃給藥，每日兩次，連續灌胃6周；對照組及模型組小鼠則以等劑量50% PEG400灌胃。

分別取模型組、OST組和空白組小鼠整腦，每組3只，提取總RNA，委托上海歐易生物醫學科技有限公司，采用 Agilent Mouse miRNA, Release 21.0芯片完成樣本檢測和分析。根據熱圖結果以及差異倍數變化值，進行差異miRNA篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數變化值≥2.0，確定為OST調控較明顯的miRNAs。

1.2.2生物信息學預測miRNA調控靶基因 利用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_70/)、PicTar(https://pictar.mdc-berlin.de/)、DIANA(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php)3個miRNA靶點預測數據庫，預測差異表達miRNA的下游靶基因，并利用Cytoscape關于miRNA的插件CytargetLinker驗證(https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker/linksets/)。

1.2.3APP高表達AD細胞模型的建立 將APP595/596、GFP以及輔助質粒pLP1、pLP2、pMDG按照一定的比例[12]轉染293T細胞；收集不同時間點的病毒液混合后，超濾管16 785×g離心1 h濃縮病毒液；將濃縮病毒液混合，并加入1%聚凝胺，轉染人神經母細胞瘤SH-SY5Y 細胞；用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光，轉染3 d后，分別用RT-PCR和蛋白質印跡法檢測APP mRNA及蛋白的表達量[12]。單純GFP轉染的正常SH-SY5Y細胞為空白對照組。

1.2.4MTT法檢測細胞活性 將終濃度分別為25、50、75、100 μmol·L-1的OST分別加入APP高表達的SH-SY5Y細胞中，并設APP高表達的SH-SY5Y細胞為模型組，GFP轉染的正常SH-SY5Y細胞為空白對照組。每組3個復孔，每孔中加入100 μL培養基，培養過夜，加入MTT試劑，避光培養4 h；棄去培養液，加入DMSO溶液，搖床震搖10 min，最后在酶標儀570 nm處測量吸光度。

1.2.5RT-PCR檢測miRNA-9和BACE-1 mRNA表達 將5 μL miRNA-9抑制劑加入到45 μL基礎培養基中，同時將5 μL脂質體2000加入到45 μL基礎培養基，室溫放置5 min，將兩種混合物融合20 min后，加入到APP高表達的SH-SY5Y細胞中，即為抑制劑組；在此基礎上，再加入終濃度為50 μmol·L-1的OST，即OST+抑制劑組。按照方法“1.2.4”設立OST組(50 μmol·L-1)、模型對照組和空白對照組。各組細胞內加入TRIzol提取RNA，稀釋后測定各組RNA純度，將RNA逆轉錄成cDNA后，-80 ℃保存。進行PCR擴增，按照以下比例配制PCR擴增體系：DreamTag PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，樣本cDNA 2 μL，水20 μL。反應條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環，72 ℃ 10 min。Image J進行光密度掃描。引物序列見Tab 1，miRNA-9引物由廣州市銳博生物科技有限公司設計并合成，引物序列因涉及保密，不予公開。

Tab 1 Sequences of primer of RT-PCR

1.2.6Western blot法觀察BACE-1表達 按照“1.2.5”設立分組，提取各組細胞蛋白，測定蛋白質濃度。各組蛋白上樣量均為50 μg，SDS-PAGE電泳，轉至PDVF膜(100 V，1 h)，脫脂奶粉TBST液封閉1 h，兔抗BACE-1 (1 ∶200) 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，與HRP標記的二抗(1 ∶2 000)雜交，凝膠成像系統拍照保存，并用 Image J定量測定信號強度。

1.2.7統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數據統計，GraphPad Prim 5.0軟件繪制統計圖。由箱線圖判斷數據是否符合正態分布。符合正態分布的計量數據以表示，多組之間的比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1OST干預后差異表達miRNA篩選結果經過歐易生物進行各組小鼠腦組織樣本芯片篩選，結果顯示，模型組中上調的miRNAs有71個，下調的miRNAs 40個；而經過OST治療后，與模型組性比，上調的miRNAs 25個，下調的miRNAs 53個，我們將差異倍數(fold change，FC)≥2作為篩選標準，其中miRNA-9差異倍數>2。熱圖結果顯示(Fig 1)，miRNA-9在3組之間表達差異明顯，可見miRNA-9是OST調控較明顯的miRNA。

2.2生物信息學驗證miRNA-9與BACE-1靶向結合通過TargetScan、PicTar、DIANA三個數據庫進行序列比對，發現miRNA-9可以與BACE-1靶向結合(Tab 2)，后續利用Cytoscape驗證與BACE-1結合的miRNA有miRNA-9、miRNA-15b、miRNA-195等(Fig 2)。證明miRNA-9與BACE-1的靶向調控作用。

Tab 2 Sequence of miRNA-9 and BACE-1

Fig 1 MicroRNA differential expression demonstrated by clustering heat map

Fig 2 miRNA-9 binding to 3′-UTR of BACE-1 determined by bioinformatics

2.3成功建立APP高表達的AD細胞模型GFP慢病毒與帶有GFP標記的APP慢病毒感染SH-SY5Y神經細胞，成功感染GFP慢病毒與帶有GFP標記的APP慢病毒的SH-SY5Y具有綠色熒光(Fig 3A)。培養3 d后，經RT-PCR和Western blot驗證，感染APP慢病毒的神經細胞具有APP基因和蛋白的高表達(Fig 3B、3C),并且APP組中APP基因的表達是空白組(GFP組)的3倍，APP組中APP蛋白的表達是空白組的2倍,說明成功建立APP過表達的AD細胞模型。

Fig 3 Establishment of AD cells with over expression of APP

2.4OST對AD細胞模型的保護作用Fig 4的MTT結果顯示，OST對APP過表達SH-SY5Y細胞具有一定的保護作用。OST在50 μmol·L-1時，細胞的活力最高，而在75 μmol·L-1之后細胞活力呈下降趨勢。因此，后續細胞的給藥濃度選擇50 μmol·L-1。

Fig 4 Effects of osthole on cell activity n=3)

**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group

2.5OST通過上調miRNA-9抑制BACE-1mRNA表達將miRNA-9抑制劑轉染到AD細胞模型中，以OST濃度50 μmol.L-1給藥，建立抑制劑組、OST+抑制劑共處理組。RT-PCR結果顯示(Fig 5)，與空白組相比，APP組中miRNA-9的表達明顯降低，給予OST治療后miRNA-9的表達相對模型組有所提高。BACE-1 mRNA在各組中的表達與miRNA-9的表達呈現負相關關系，模型組中BACE-1表達明顯增多，OST可以降低BACE-1的表達，抑制劑組BACE-1表達最多，OST與抑制劑共處理組BACE-1表達介于抑制劑組和OST組之間。

2.6OST通過上調miRNA-9抑制BACE-1蛋白的表達Fig 6的Western blot結果顯示，與GFP組相比，APP組的BACE-1蛋白明顯增多，給予OST治療后，BACE-1蛋白表達相對APP組有所降低，而抑制劑組BACE-1蛋白表達最多，OST與抑制劑共處理組BACE-1蛋白表達介于OST組和抑制組之間。說明OST可以通過上調miRNA-9，抑制BACE-1蛋白的表達。

3 討論

AD是一種常見的嚴重影響人們生活質量的疾病，其特征為腦內積聚老年斑及神經原纖維纏結[13]，AD現已成為降低人類生活質量最嚴重的疾病之一。AD發生存在著多種假說，其中Aβ學說是當今的研究熱點。正常人腦中Aβ的產生與降解會保持平衡，而BACE-1活性增強會加速對APP的裂解，從而大量生成Aβ，導致Aβ的沉積，產生神經毒性[14]，激活一系列病理改變，進而誘導神經細胞的凋亡。因此，減少腦內APP裂解，即抑制BACE-1活性，就可以達到治療AD的作用。

Fig 5 Effects of osthole on expression of miR-9 and

**P<0.01vsGFP,##P<0.01vsAPP

Fig 6 Expression of BACE-1 with osthole treatment in cells n=10)

**P<0.01vsGFP;##P<0.01vsAPP

本實驗室前期研究表明，OST作為一種天然香豆素類化學成分，可以通過miRNAs直接調控下游靶基因，并且可以促進神經發生，改善APP/PS1小鼠腦區內學習認知能力[15]。本研究通過基因芯片技術，篩選OST干預APP/PS1小鼠后差異表達的miRNA-9，并且通過生物信息學分析，驗證miRNA-9可以調控靶基因BACE-1的表達，將miRNA-9抑制劑轉入APP高表達的AD細胞模型，發現模型組與對照組相比，BACE1蛋白的表達明顯增高。給藥后，BACE1蛋白表達相對模型組明顯降低，抑制劑組BACE1蛋白表達最高，OST與抑制劑共處理組BACE1蛋白表達在給藥組與抑制劑組之間，差異皆有統計學意義。說明OST可以通過上調miRNA-9，抑制BACE-1表達，從而達到治療AD的作用。獨活抗AD的分子機制比較復雜，調控miRNA-9的內在機制以及對其他miRNA的調控作用仍是未知，后續要通過大量實驗研究，為獨活應用于臨床治療AD提供依據。

綜上所述，OST能夠靶向調節miRNA-9，抑制BACE-1表達，從而達到治療AD的作用，本研究為治療AD相關新藥研發提供了重要的實驗依據。