運動通過Parkin抗凋亡通路 抑制AD小鼠海馬細胞凋亡

畢 超, 呂 康, 何 標

(安徽師范大學 體育學院，安徽 蕪湖 241002)

細胞凋亡(Apoptosis)是指機體為維持內環境穩定、受凋亡基因調控的細胞有序死亡的現象，細胞凋亡受一系列凋亡相關基因的精確控制，如Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族、TNF蛋白家族、細胞色素C(Cytochrome C，cyt-c)等蛋白家族，調控細胞凋亡的基因相互作用形成細胞凋亡信號傳導通路，主要有死亡受體介導的細胞凋亡、線粒體通路介導的細胞凋亡和內質網應激凋亡通路介導的細胞凋亡三條通路。細胞凋亡對維持機體正常發育和自身穩態具有重要意義。而細胞凋亡異常將導致腫瘤、帕金森綜合征及阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)在內的多種疾病的發生。

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性神經系統疾病，多發于中老年人群，以記憶力減退和認知功能障礙為主要臨床特征，以神經纖維纏結、老年斑和突觸丟失為主要病理特征[1]。細胞凋亡導致AD海馬神經元大量丟失，最終影響海馬的學習記憶功能。積極的身體活動作為一種干預手段能夠有效緩解AD的發生，有研究證實長期中等強度的跑臺運動顯著抑制NSE/APP轉基因AD小鼠海馬Caspase-3、Caspase-9和Bax等促細胞凋亡基因的表達，提高抑制細胞凋亡基因Bcl-2的表達水平，提高NSE/APP轉基因小鼠神經細胞抗凋亡能力。但運動是如何調控細胞凋亡相關基因抑制轉基因小鼠海馬神經細胞的凋亡尚不清楚。而Parkin-NEMO-OPA1通路具有抑制細胞凋亡的能力，運動是否通過調控Parkin-NEMO-OPA1通路抑制海馬神經細胞凋亡？受上述啟示，本研究探討運動調控Parkin-NEMO-OPA1信號通路對APP/PS1轉基因小鼠海馬神經細胞凋亡的影響及機制。

1 實驗材料及方法

1.1動物及分組

選購3月齡雄性APP/PS1轉基因小鼠12只(南京大學模式動物研究所)，許可證號：SCXK(蘇2015—0001)。將APP/PS1轉基因小鼠隨機分為轉基因運動組(TE,N=6)和轉基因對照組(TC,N=6)，選取同系野生型小鼠作為正常對照組(C,N=6)。實驗動物置于標準動物房分籠飼養。

1.2 運動干預方案

實驗小鼠適應性喂養2周后，TE組小鼠進行1周的適應性跑臺訓練。適應性訓練結束后對TE組小鼠進行運動干預。參照文獻[2]中運動強度，以小鼠最大攝氧量45%-55%的強度對TE組小鼠進行10周的跑臺運動，每周5次，每次訓練持續時間為45min，運動結束后小鼠為7月齡。

1.3 取 材

TE組小鼠末次運動后，對所有實驗小鼠禁食12小時，脫頸處死，分離海馬，低溫保存，待測。

1.4 實時熒光定量(RT-PCR)測試

采用RT-PCR檢測方法對Parkin、NEMO、OPA1、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、cyt-c mRNA的表達水平進行檢測，用Trizol法提取小鼠海馬內總的RNA，以20μL逆轉錄反應體系得到穩定的cDNA。實驗操作步驟按照文獻[3]進行。按要求設計合成引物(由上海生工生物有限公司合成)，引物序列見表1。按照RT-PCR擴增循環參數，以20μL體系進行RT-PCR實驗，記錄Ct值。根據2-△△Ct法計算相對表達量。所用儀器為(Thermo Fisher Scientific，美國，型號A28132)。

1.5 數據統計

2 結 果

2.1 各組小鼠海馬細胞凋亡基因表達水平

本文采用RT-PCR技術檢測各組小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、cyt-c mRNA的表達情況，如表2所示：與C組相比較，TC組小鼠海馬Caspase-3mRNA的表達水平升高，差異具有極顯著性(p<0.01)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Caspase-3mRNA的表達水平下降，差異具有極顯著性(p<0.01)。與C組相比較，TC組小鼠海馬Caspase-6mRNA表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Caspase-6mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬Caspase-8mRNA的表達水平升高，差異具有極顯著性(p<0.01)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Caspase-8mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬cyt-cmRNA表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬cyt-cmRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)(如圖1所示)。

表1 引物序列一覽表Table 1 Primer sequence of gene

表2 各組小鼠Caspase-3，Caspase-6，Caspase-8，cyt-c相對于GAPDH的mRNA表達水平

與C組相比，*p<0.05,**p<0.01，與TC組相比，△p<0.05,△△p<0.01

2.2 各組小鼠海馬Parkin抗凋亡通路基因表達水平

為研究運動對Parkin-NEMO-OPA1抗細胞凋亡通路的影響，運用RT-PCR技術檢測了APP/PS1轉基因小鼠海馬Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達情況，如表3所示，與C組相比較，TC組小鼠海馬Parkin mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Parkin mRNA的表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬OPA1mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬OPA1mRNA的表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬NEMO mRNA表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬NEMO mRNA的表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)(如圖2所示)。

表3 各組小鼠Parkin，NEMO， OPA1相對于GAPDH的mRNA表達水平

與C組相比，*p<0.05,與TC組相比，△p<0.05

3 討 論

細胞凋亡是真核細胞為維持內環境穩定而啟動的內部死亡機制，凋亡信號傳導通路精密調控機體的細胞凋亡，其中線粒體通路介導的細胞凋亡最為經典[4]。Caspase家族對細胞凋亡起著關鍵性作用，是調控細胞凋亡的關鍵酶，Caspase有多個亞型，其中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是細胞凋亡的執行者，而Caspase-8和Caspase-9則是細胞凋亡的啟動者。不同的細胞凋亡信號通路相互作用，激活Caspase-3和Caspase-6，誘發細胞凋亡[5]。神經元細胞過度凋亡進一步降低了神經元的存活，影響大腦功能，而AD腦內神經細胞大量丟失則是神經細胞過度凋亡的結果。AD的發病與Aβ誘導的神經細胞凋亡密切相關，淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的過度表達、持續的氧化應激和腦損傷均可導致細胞凋亡的增多。

本研究發現，7月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、cyt-c、Caspase-8mRNA表達均顯著高于正常對照組，提示APP/PS1轉基因小鼠海馬細胞凋亡增加。神經細胞凋亡始于AD早期，甚至早于老年斑和神經原纖維纏結形成之前。AD患者海馬Aβ含量增加，Aβ通過激活Caspase誘導神經細胞凋亡，而Caspase-3又參與了APP的代謝過程，導致Aβ的生成增多。劉慧莉等人[6]通過TUNEL和NISSL染色方法證實APP/PS1轉基因小鼠海馬出現大量的神經細胞凋亡和齒狀回神經元丟失現象。Aβ導致的細胞凋亡是通過Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族基因調控的。Aβ可能通過改變Bcl-2/Bax比值，同時激活Caspase并引發Caspase酶鏈鎖反應，促進神經細胞過度凋亡。Aβ可以降低Bcl-2的表達水平，誘導神經細胞凋亡，而過度表達Bcl-2可降低Aβ的神經毒性，提高神經元的存活率。

APP/PS1轉基因小鼠作為研究較多轉基因AD小鼠，7月齡時腦內可見明顯的Aβ沉積，海馬神經元丟失增多。本研究結果證實，7月齡APP/PS1轉基因小鼠抑制海馬神經細胞凋亡的能力低于野生對照組，而10周的跑臺運動顯著降低APP/PS1小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和cyt-c mRNA的表達水平，提示跑臺運動通過減少促凋亡因子的表達抑制AD小鼠海馬細胞凋亡。研究[7]證實，16周的跑臺運動降低NSE/APP轉基因小鼠海馬cyt-c、Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達水平，增加了NSE/APP轉基因小鼠海馬Bcl-2mRNA的表達水平。研究[8]發現，3個月的跑臺運動降低NSE/hPS2m轉基因小鼠大腦皮層Caspase-3mRNA的表達水平，提高大腦皮層Bcl-2/Bax比值。上述研究結果提示，運動通過提高海馬神經細胞抗凋亡能力，達到預防和緩解AD的目的。

海馬神經細胞異常凋亡將導致認知功能障礙疾病的發生，AD患者腦內神經細胞凋亡增多。運動可以增強突觸可塑性，抑制神經細胞凋亡，但運動調節APP/PS1轉基因小鼠神經細胞凋亡的確切機制尚不明確。目前就運動影響APP/PS1轉基因AD小鼠神經細胞凋亡的研究成果相對較少，研究[8]證實，小強度的跑臺運動通過抑制海馬神經細胞凋亡，減少APP/PS1轉基因小鼠海馬齒狀回神經元的丟失。但該研究僅通過TUNEL和NISSL染色方法觀察了跑臺運動對AD小鼠海馬齒狀回細胞凋亡的影響情況，沒有對細胞凋亡相關基因表達情況進行檢測。本研究對APP/PS1轉基因小鼠進行10周的跑臺運動干預，結果證實，跑臺運動通過下調促神經細胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和cyt-c mRNA的表達水平，提高了APP/PS1轉基因小鼠海馬細胞抗凋亡能力，降低了海馬神經元細胞凋亡。

Parkin是位于6q25-27與家族性帕金森綜合征密切相關的基因，是最早發現的家族性帕金森綜合征致病基因并命名為Parkin[9]。Parkin表達于人體所有組織，Parkin可以通過底物蛋白的泛素化調節線粒體自噬、蛋白降解，參與帕金森綜合征的發病過程等。Parkin能夠抑制由線粒體應激和內質網應激誘導的細胞凋亡，發揮神經保護功能。Parkin參與線粒體通路介導的細胞凋亡過程，在細胞受到外界刺激情況下，Parkin通過募集線性泛素分子組合成復合體，通過提高NF-κB關鍵調節分子(NF-κB essential modulator，NEMO)線性泛素化水平，然后進一步激活線粒體視神經萎縮相關蛋白1(optic atrophy type1，OPA1)，提高OPA1的轉錄水平，OPA1上調能夠維持線粒體完整性和阻止細胞凋亡，形成Parkin-NEMO-OPA1信號通路。cyt-c是位于線粒體內膜的水溶性蛋白，是最早發現的由線粒體釋放的促細胞凋亡蛋白，正常情況下cyt-c不能透過線粒體外膜，而當線粒體外膜蛋白聚合成膜通透轉運孔(permeability transition pore，PTP)復合體，外界刺激使PTP通透性增加導致水分進入線粒體，并最終引起cyt-c釋放，而胞質內以單體存在的Bax在受到外界刺激時形成聚合物整合到線粒體上，使線粒體外膜通透性增加，導致cyt-c釋放增多，從而誘導了細胞凋亡的發生。Parkin能夠抑制因凋亡刺激誘導的線粒體cyt-c的釋放，證實了Parkin抗細胞凋亡作用與線粒體介導的細胞凋亡相關。而線粒體cyt-c的釋放同樣受OPA1活性的影響，提示Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路通過抑制線粒體cyt-c的釋放抑制細胞凋亡的發生。本實驗結果顯示，7月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1信號通路關鍵分子Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平顯著低于正常對照組，差異具有顯著性，而cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達水平均顯著高于正常對照組，提示APP/PS1轉基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1抗細胞凋亡能力下降，導致轉基因小鼠海馬線粒體cyt-c釋放增多，上調Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8等基因的表達水平，引起海馬細胞凋亡增多。

耐力訓練增加了2型糖尿病小鼠海馬Parkin和OPA1的表達水平[10]。近期的研究也證實，2周的跑臺訓練顯著增加腦缺血大鼠皮層OPA1的表達水平[11]，提示跑臺運動可能通過提高OPA1mRNA的表達水平，發揮神經保護功能。目前還沒有就Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路對APP/PS1轉基因小鼠海馬線粒體介導的細胞凋亡方面的研究。本研究發現，10周的跑臺運動上調APP/PS1轉基因小鼠海馬Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平，抑制APP/PS1轉基因小鼠海馬cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達，提示跑臺運動通過提高Parkin抗凋亡通路關鍵分子Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平，降低線粒體cyt-c的釋放和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA表達水平，抑制APP/PS1轉基因小鼠海馬細胞凋亡。

4 結 論

APP/PS1轉基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路mRNA的表達水平下降導致海馬線粒體cyt-c和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8等促凋亡基因的表達水平提高，導致APP/PS1轉基因小鼠海馬細胞凋亡增加。而10周的跑臺運動通過提高Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平，降低線粒體cyt-c的釋放和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達水平，抑制AD小鼠海馬細胞凋亡。