GC-MS法測定鹽酸金霉素眼膏中16種多環芳烴含量

肖欽欽 劉緒平 段和祥 陳希 張銀花

(江西省藥品檢驗檢測研究院，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，南昌 330029)

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上苯環的碳氫化合物的總稱，是重要的環境和食品污染物，具有很強的致畸、致癌和致突變性。PAHs可以通過呼吸或者直接的皮膚接觸使人體致癌。1979年美國環保總署(EPA)列出的129種優先監控的污染物中有16種為PAHs，1982年EPA《城市和工業廢水的有機化學分析方法多環芳烴的測定》(METHOD 610)中引入16種PAHs的清單[1]。我國第一批68種優先控制的污染物中也將7種多環芳烴列入其中[2]。歐洲議會和歐盟理事會發布的第2005/69/EC號指令及REACH法規附件X Ⅶ50均對用于輪胎生產的填充油中的苯并[a]芘及8種PAHs的總含量進行了限量規定[3-4]。德國2011年11月29日修訂后的ZEK 01.4-08《GS認證過程中PAHs的測試和驗證》也對18種PAHs制定了具體限量指標[5]。由于苯并[a]芘是首個被發現的環境化學致癌物，而且致癌性很強，故常以苯并[a]芘作為多環芳烴的代表，它占全部致癌性多環芳烴的1%～20%。

鹽酸金霉素眼膏處方中99.5%為輔料凡士林和液狀石蠟，它們均是從石油中得到的多種烴的半固體或液態混合物，易含有多環芳烴等雜質。眼膏劑涂于眼睛患處，直接與人體皮膚黏膜長時間接觸，多環芳烴類物質超標，將嚴重危害人類身體健康。本研究采用GC-MS法分析鹽酸金霉素眼膏中是否有污染PAHs的風險，通過對輔料中16種PAHs含量的測定及對制劑生產工藝的模擬，探討導致制劑中PAHs異常的原因，為該類劑型的安全性評估提供數據支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B-7000C氣相色譜質譜聯用儀(Aglient公司)，Sartorius BS200S電子天平(Sartorius公司)，N-EVAP24氮吹儀(Organomation公司)，10mL具塞刻度試管。

1.2 試藥

鹽酸金霉素眼膏為2018年國家評價性抽驗樣品，共210批，涉及5個生產企業。輔料凡士林和液狀石蠟為其中4個制劑企業提供，各1批。

16種多環芳烴標準混合溶液：萘(nahpthalene,1001μg/mL)，苊烯(acenaphthylene, 1998μg/mL)，苊(acenaphthene, 995.9μg/mL)，芴(fluorene, 200.1μg/mL)，菲(phenanthrene, 100.2μg/mL)，蒽(anthracene,100.2μg/mL)，熒蒽(fluoranthene, 200.1μg/mL), 芘(pyrene, 99.84μg/mL)，苯并[a]蒽(benzo[a]anthracene,100.4μg/mL)，?(chrysene, 100.6μg/mL)，苯并[b]熒蒽(benzo[b]fluoranthene, 200.1μg/mL)，苯并[k]熒蒽(benzo[k]fluoranthene, 100.4μg/mL)，苯并[a]芘(benzo[a]pyrene, 100.7μg/mL)，茚并[1,2,3-cd]芘(indeno[1,2,3-cd]pyrene, 99.96μg/mL)，二苯并[a,h]蒽(dibenz [a,h]anthracene, 199.9μg/mL)，苯并[g,h,i]苝(benzo[g,h,i]perylene, 200μg/mL)，溶劑為甲醇:二氯甲烷=1:1；正己烷、乙腈均為色譜純。

2 實驗方法

2.1 溶液配制

混合標準儲備液：移取16種PAHs標準混合溶液0.5mL置于100mL量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，作為標準儲備液，密封，低溫避光保存。

供試品溶液：取鹽酸金霉素眼膏混勻，精密稱取混合均勻的試樣1.0g，置于10mL具塞刻度試管中，加正己烷6mL，振蕩搖勻使溶解，2000r/min離心5min后取上清液3mL至另一10mL具塞刻度試管中，加正己烷飽和的乙腈3mL，振蕩提取1min，收集乙腈層。再用正己烷飽和的乙腈按上述步驟提取2次，合并乙腈層，渦旋混勻，再氮吹至少于1mL，再加乙腈定容至1mL，即得(必要時可適當稀釋)。

2.2 分析條件

2.2.1 氣相色譜條件

色譜柱DB-5MS毛細管柱(30m×0.25mm,0.25μm)；載氣：高純氦氣(純度大于99.999%)，柱流速：1.0mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣體積：1.0μL，不分流進樣；程序升溫：初始溫度：90℃，以20℃/min升溫至220℃，再以5℃/min升溫至320℃，保持2min，共計28.5min。

2.2.2 質譜條件

離子化方式：電子轟擊離子源(EI)；電離能量70eV；碰撞氣：高純氬氣(99.999%)；離子源溫度230℃；色譜-質譜接口溫度280℃；溶劑延遲時間3min；數據采集模式：選擇離子監測模式(SIM)。監測離子信息詳見表1。

2.3 方法學驗證

表1 16種多環芳烴的保留時間與特征離子信息Tab.1 The informations of retention time and characteristic ions for the determination of PAHs

2.3.1 線性試驗

分別移取混合標準儲備溶液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10.0、2.0和5.0mL，依次至100、100、100、100、100、100、100、10和10mL量瓶中，再加乙腈稀釋并定容至刻度，搖勻，配成一系列濃度的混合標準曲線溶液①～⑨。分別精密量取上述系列混合標準曲線溶液①～⑨與混合標準儲備液⑩各l.0μL，按“2.2”項下條件進行分析。以定量離子的峰面積A為縱坐標，濃度c為橫坐標，進行線性回歸。結果表明16種PAHs在相應濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.993，回歸方程和相關系數見表2。

2.3.2 檢出限和定量限

取上述混合標準曲線溶液逐步稀釋后精密吸取各溶液1μL，注入GC-MS儀，記錄質譜圖。各組分以在定量離子圖譜中信噪比滿足1:3為檢測限(LOD)，以在定量離子圖譜中信噪比滿足1:10為定量限(LOQ)，測得16種PAHs的檢出限和定量限如表2所示。

2.3.3 空白實驗

用正己烷替代樣品，按“2.1”項下供試品溶液的制備方法，制備試劑空白。精密量取試劑空白和標準混合溶液1μL注入GC-MS儀，按“2.2”項下條件進行分析，記錄質譜圖。標準混合溶液的GC-MS圖譜見圖1，從GC-MS質譜圖中各物質的保留時間及定量、定性離子豐度比結果可以看出試劑空白溶液中含有少量菲和熒蒽(響應為1725和490)，從線性回歸方程可以看出，兩種物質的標曲截距值(1944和1154)均大于試劑空白中上述成分的響應值，即可以忽略試劑空白中上述兩種成分帶來的干擾。

表2 16種PAHs線性回歸方程、LOD和LOQTab.2 Linear regression equations, LODs and LOQs of PAHs

圖1 混合標準溶液GC-MS圖譜Fig.1 Representative MRM chromatograms from the maxed reference standards solution of 16 PAHs

2.3.4 準確度和重復性

取混合均勻的空白試樣1.0g兩份，分別置于10mL具塞刻度試管中，加正己烷6mL，振蕩搖勻使溶解，2000r/min離心5min后分別取上清液3mL至另兩支10mL具塞刻度試管中，分別加混合標準曲線溶液⑤和⑦各1mL后，再加正己烷飽和的乙腈2mL，振蕩提取1min，收集乙腈層。再用正己烷飽和的乙腈按上述步驟提取2次，合并乙腈層，渦旋混勻后再氮吹至少于1mL，再補加乙腈至1mL，作為回收待測溶液“(1)”和“(2)”，各平行制備6份。

測得16種PAHs的平均回收率為72%～118%，回收率的RSD為0.5%～2.5%，表明本方法準確度和重復性結果良好。

2.4 樣品測定

采用本研究建立的16種PAHs的GC-MS檢測方法，對210批鹽酸金霉素眼膏、4批凡士林和4批液狀石蠟進行檢測，結果詳見表3～4。實驗結果發現鹽酸金霉素眼膏中均未檢出苊烯、芴、苯并[k]熒蒽和二苯并[a,h]蒽這4種成分，而萘、菲、芘、苯并[g,h,i]苝4種成分檢出率較高，最高檢出率達85%。在檢出成分中，苊、蒽、熒蒽、苯并[a]蒽、?、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘這7種成分檢出含量最高值均小于0.5mg/kg，總PAHs含量均小于10mg/kg。檢出率最高的成分為苯并[g,h,i]苝，其檢出含量最高值為5.7mg/kg，含量大于0.5mg/kg的樣本共40批次，涉及生產企業及批次分別為廠家A 36批次、廠家G 2批次、廠家D和F各1批次。

凡士林和液狀石蠟均檢出菲，液狀石蠟均未檢出苯并[g,h,i]苝，而凡士林均檢出，其中廠家A所提供的凡士林檢出苯并[g,h,i]苝含量最高，超出其他廠家3倍。

2.5 生產工藝模擬試驗

鹽酸金霉素眼膏生產中，凡士林需在約160～170℃加熱120min進行滅菌，由于多環芳烴類物質在高溫條件下可能經熱聚反應產生，從而導致產品中苯并[g,h,i]苝含量異常偏高。針對這一可能性，本研究設計了凡士林滅菌模擬試驗，即將制劑生產企業提供的凡士林置于160℃烘箱中分別加熱0、2和4h，檢測凡士林在加熱過程中是否會導致苯并[g,h,i]苝含量明顯升高。實驗結果見圖2所示，凡士林經160℃加熱2h后苯并[g,h,i]苝含量相對有所升高(最大上升26%)，但相對制劑中的苯并[g,h,i]苝含量，該變化并不明顯，說明生產工藝并不是導致產品中苯并[g,h,i]苝含量異常偏高的主要原因。

3 討論

在德國2015年7月1日實施的GS產品認證PAHs管控要求中，對第2類其他類產品中PAHs的限度規定，與皮膚長時間接觸(超過30s)的材料其苯并[g,h,i]苝限值應小于0.5mg/kg[6]。本研究發現國產鹽酸金霉素眼膏中苯并[g,h,i]苝含量超過0.5mg/kg的樣品較多，超限率達18%，平均含量為3.8mg/kg，存在較大質量風險。針對部分企業生產的鹽酸金霉素眼膏中檢出苯并[g,h,i]苝含量異常偏高的情況，分析其原因可能主要為輔料質量較差所致。鑒于從輔料凡士林中均檢出苯并[g,h,i]苝，其中來源于廠家A的黃凡士林檢出的苯并[g,h,i]苝含量遠較其它廠家高；而在液狀石蠟中苯并[g,h,i]苝均未檢出，提示直接影響鹽酸金霉素眼膏質量及安全性的關鍵因素是輔料凡士林的優劣。此外，模擬試驗證明，不恰當的生產工藝可能導致制劑中苯并[g,h,i]苝含量增加，但不是異常偏高的主要原因。

表3 鹽酸金霉素眼膏多環芳烴含量測定結果Tab. 3 Results of the determination of PAHs in chlortetracycline hydrochloride eye ointment

表4 輔料多環芳烴含量測定結果Tab.4 Results of the determination of PAHs in excipients

圖2 凡士林中苯并[g,h,i]苝含量隨高溫加熱時間變化趨勢Fig.2 Trends of the content of benzo[g,h,i]perylene in vaseline with the time of heating

鑒于多環芳烴類物質存在致畸、致癌、致突變等3大主要危害，雖然目前國內還未對藥品中多環芳烴的污染限量有相關的規定，對廣泛使用凡士林為輔料的眼膏劑、軟膏劑中的PAHs進行限值規定，并進行安全評估有重要的意義。