采用試驗設計理念建立并優化丙酸交沙霉素有關物質分析方法

張夏 姚尚辰 胡昌勤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

丙酸交沙霉素(圖1)是交沙霉素9位丙酰化產物，屬于半合成大環內酯類抗生素，臨床上廣泛用于治療化膿性鏈球菌引起的各類感染，也可用于對青霉素、紅霉素耐藥的葡萄球菌感染。由于交沙霉素發酵過程中可能引入多種小組分，其本身含有多個衍生化位點，衍生化過程中還可能產生多種的衍生化產物等[1]，因此丙酸交沙霉素組分/雜質的種類復雜，各組分/雜質的含量差異較大，增加了其有關物質合理控制的難度。按大環內酯類抗生素的控制理念，開發具有高專屬性的HPLC方法，保證分析方法具有理想的重復性和粗放性，方便地實現對樣本中諸組分/雜質的快速定位，仍是方法學研究的關鍵[2]。

本文采用試驗設計(design of experiment, DoE)的理念建立丙酸交沙霉素HPLC有關物質分析方法。與傳統的 “試錯法(trial and error)”或者“單因素變化法(one factor at a time)”相比較，試驗設計方法應用數理統計學的原理，通過合理地安排試驗、獲取數據、對結果進行綜合分析，從而實現對影響分離的諸關鍵因素(強溶劑保留、流動相pH、柱溫等)與溶質保留值、分離度的關系等的充分認知[3]，因此特別適用于對復雜組成的大環內酯類抗生素有關物質分析方法的建立與優化。

1 實驗部分

1.1 試藥

丙酸交沙霉素原料(來源：日本安斯泰來制藥公司，批號：PJTYB036、PJTYB037、PJTYC001)；丙酸交沙霉素標準品(來源：中國食品藥品檢定研究院，批號：130361-200301，含量：85.3%)。

醋酸銨(國藥集團化學試劑有限公司，化學純，批號：F20100910)，乙腈為色譜純，重蒸水。

1.2 儀器

戴安U3000型液相色譜系統(Thermo Fisher Scienti fi c公司，Waltham，MA)。

1.3 方法

圖1 丙酸交沙霉素的結構式Fig.1 The structure of josamycin propionate

用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以0.015mol/L醋酸銨溶液為流動相A，乙腈為流動相B，按表1進行梯度洗脫。流速為1.0mL/min，檢測波長為231nm；柱溫為40℃。取丙酸交沙霉素標準品適量，加乙腈溶解并稀釋制成約含1mg/mL的溶液，作為系統適用性溶液。取20μL注入液相色譜儀。

表1 梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution program

1.4 軟件

試驗設計軟件為Design Expert(試用版，Stat-Ease公司，Minneapolis，MN)。

2 結果與討論

2.1 已有方法的比較

采用各國藥典及文獻丙酸交沙霉素有關物質分析方法(表2～3)分析丙酸交沙霉素樣品，各國藥典方法的色譜圖見圖2，文獻方法的色譜圖見圖3。從主成分的峰形看，日本藥局方方法及文獻方法略好，但全部方法的分離度均不理想；中國藥典方法有嚴重的共流峰現象；且實驗時發現柱壓緩慢升高，可能與流動相中有機相比例過高[磷酸鹽緩沖液-甲醇(18:82, V/V)]有關。

對比各色譜統分離條件與分析結果可見，采用C18色譜柱、醋酸鹽和乙腈為流動相有利于各成分的分離，但無法通過簡單的試錯法等得到理想的分析結果。因此采用DoE方法，以15mmol醋酸銨溶液-乙腈(30:70)為流動相、柱溫40℃、流速1mL/min作為初始條件進行優化。

2.2 DoE設計參數的選擇

DoE設計需要首先明確自變量與因變量。通過初步試驗，對影響丙酸交沙霉素分離結果關鍵色譜參數與指標進行篩選，選擇對丙酸交沙霉素分離有顯著影響的色譜參數為自變量，對直接與分離結果相關的指標如難分離物質的分離度、色譜峰個數等為因變量，進行DoE優化。

按初始分析條件，選擇10支不同品牌的色譜柱分析丙酸交沙霉素，結果顯示，Xtimate C18(250mm×4.6mm, 5μm, Acchrom)的總體分離情況最好，以此作為DoE優化實驗中的色譜柱。

表2 丙酸交沙霉素各國家標準中的有關物質方法對比Tab.2 Comparison of related substance methods in different national pharmacopoeias

表3 丙酸交沙霉素文獻方法對比Tab.3 Comparison of related substance methods in different literatures

篩選流動相中影響分離的關鍵因素。按初始分析條件，保持洗脫強度不變，改變有機相類型。以流動相15mmol醋酸銨溶液-甲醇(35:65, V/V)、15mmol醋酸銨溶液-四氫呋喃(35:65, V/V)分析丙酸交沙霉素樣品，發現色譜峰峰形不佳，主峰前部抬高，且雜質分離較差，說明甲醇和四氫呋喃不適合丙酸交沙霉素雜質分離。改變流動相中乙腈的比例，采用流動相15mmol醋酸銨溶液-乙腈(35:65,V/V)、(30:70, V/V)、(25:75, V/V)分析丙酸交沙霉素樣品，結果顯示乙腈比例對雜質分離的情況影響較大。改變醋酸銨溶液的濃度，分別以3、15和100mmol醋酸銨溶液分析丙酸交沙霉素樣品，結果顯示緩沖鹽濃度對雜質分離情況影響較大。分別改變流動相醋酸銨溶液的pH值(15mmol醋酸銨溶液的pH約為6.8)為pH5.0和pH8.0，分析丙酸交沙霉素樣品，結果顯示，pH5.0時峰形前延，而pH8.0時對分離影響不大，提示，DoE優化中醋酸銨溶液的pH值可不作為重要因素進行優化。

圖2 丙酸交沙霉素有關物質各國藥典方法色譜圖Fig.2 The typical chromatograms of related substance methods in different national pharmacopoeias

圖3 丙酸交沙霉素文獻方法色譜圖Fig.3 The typical chromatograms of related substance methods in different literatures

進一步確定其它色譜參數的影響。以柱溫30、40和50℃分析丙酸交沙霉素樣品，結果顯示，柱溫對雜質分離情況影響較大。而改變流速，以流速0.8、1.0和1.2mL/min分析丙酸交沙霉素樣品，結果顯示流速對分離的影響不大。

基于以上試驗，確定DoE設計中，選擇流動相中的有機相比例、緩沖鹽濃度和柱溫作為優化中的自變量，主峰和主峰前色譜峰的分離度(Rs)、第一區間雜質個數(Nimp1)、第二區間雜質個數(Nimp2)作為優化中的因變量。

2.3 DoE優化

采用響應曲面設計(RSM)。運用Design Expert軟件得到試驗運行表，運行試驗，得到響應結果(表4)；利用響應值建模，得到各模型參數(表5)；對各模型進行方差分析(表6)，Rs模型的R2偏低，方程回歸性稍差；其余模型各參數良好。各模型的回歸方程見表7。

表4 丙酸交沙霉素試驗運行表及結果Tab.4 The run list and results of each run

擾動圖可直觀地說明因素對響應結果的影響。圖4a顯示因素B、C對Rs影響顯著，Rs隨因素B(緩沖鹽濃度)、C(柱溫)的增大而減少。圖4b顯示因素B、C對Nimp1影響顯著，Nimp1隨因素C增大而增大，隨因素B增大而減少。從圖4c可以看出，因素A(有機相比例)、B、C對Nimp2影響顯著，Nimp2隨因素B增大而減少，隨因素A、C增大先增大后減少。

建立因素對響應結果的響應面。由于Rs采用線性模型擬合，因此因素間無交互作用(圖4d)；因素B、C之間也無交互作用，但因素B具有二階作用(圖4e)；而因素A、B間具有交互作用(圖4f)。

表5 丙酸交沙霉素模型參數Tab.5 The model parameters of each response

表6 丙酸交沙霉素方差分析表Tab.6 The analysis of variance table

采用滿意度函數法，求解丙酸交沙霉素色譜系統的最優值，根據優化標準(表8)可得到14個解(表9)，滿意度響應面見圖5。按解1條件分析丙酸交沙霉素，并以預測誤差(PE)為指標評價模型的預測性， Rs、Nimp1、Nimp2的PE值的絕對值均小于20，說明模型預測性良好。據此確定了丙酸交沙霉素最優化色譜系統：流動相為15mmol醋酸銨溶液-乙腈(34:66, V/V)、柱溫40℃、流速1.0mL/min、色譜柱為Xtimate C18(250mm×4.6mm, 5μm)，色譜圖見圖6。

表7 丙酸交沙霉素的回歸方程Tab.7 The regression equations of each model

圖4 丙酸交沙霉素響應結果的擾動圖和響應面Fig.4 The perturbation diagram and response surface of each response

表8 丙酸交沙霉素滿意度函數法優化標準Tab.8 The optimization standards using desirability function method

表9 滿意度函數法得到的丙酸交沙霉素色譜系統最優值Tab.9 The optimal HPLC condition using desirability function method

圖5 丙酸交沙霉素色譜系統的滿意度響應Fig.5 The desirability surface of the HPLC system

如采用梯度洗脫的方式，流動相A為15mmol醋酸銨溶液，流動相B為乙腈，在0、24、44、50、51和65min時，流動相B的比例為66%、66%、80%、80%、66%和66%，流速為1.0mL/min，柱溫40℃，還可適當減少分析時間(圖7)。

2.4 方法學驗證

2.4.1 精密度試驗

圖6 丙酸交沙霉素色譜系統典型色譜圖Fig.6 The typical chromatogram of the developed method

圖7 丙酸交沙霉素梯度方法色譜圖Fig.7 The typical chromatogram of the developed method using gradient elution

將精密度試驗溶液連續進樣6針，以主成分峰面積計，得到方法的日內精密度為0.23%，以A組分峰面積計，得到方法的日內精密度為0.20%，均小于2.0%，表明本試驗方法的精密度良好。

2.4.2 線性試驗

分別以濃度對主峰峰面積、A組分峰面積進行回歸，丙酸交沙霉素主成分和A組分在0.0004～1.9830mg/mL的濃度范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系(R2均為0.9999)。

2.4.3 檢測限與定量限

以噪音的3倍為指標，得到方法的最低檢測限為0.59ng；以噪音的10倍為指標，得到方法的最低定量限為1.77ng。以丙酸交沙霉素的最低檢測限計，0.005%的雜質能夠被檢出，滿足試驗要求。

2.5 實際樣品的測定

3批丙酸交沙霉素原料含量和有關物質的測定結果見表10。3批原料的含量和有關物質均符合中國藥典、進口注冊標準和歐洲藥典的限度要求。

表10 丙酸交沙霉素原料含量及有關物質的測定結果Tab.10 The determination results of raw materials

3 結論

針對大環內酯類抗生素雜質譜復雜的特點，基于試驗設計理念，采用響應曲面法建立了丙酸交沙霉素有關物質分析方法。得到的最佳色譜條件優于丙酸交沙霉素各國藥典及文獻的有關物質方法，并對影響分離結果的各因素有了全面的理解。該思路可以為其他大環內酯類抗生素有關物質分析方法的建立和優化提供借鑒。該色譜條件采用揮發性緩沖鹽作為流動相，也便于后續對新發現的組分/雜質進行質譜分析。