苦黃注射液多組分成分測定及成品的輸液穩定性研究

何 遠，石建麗，嚴榴芽

(余姚市人民醫院藥劑科，浙江 余姚，315400)

近幾年來，臨床上應用中藥注射液造成的不良事件時有發生，因此，中藥注射液的成品輸液穩定性已經逐漸成為研究的熱點[1]。為了探討中藥注射液從配制到輸液過程中質量的變化，以及室內光照對中藥注射液成品輸液穩定性的影響，本研究考察了苦黃注射液的質量及成品輸液的穩定性，以期為臨床安全用藥提供參考，減少不良事件的發生。苦黃注射液是由苦參、大黃、茵陳蒿、柴胡和大青葉經過加工制成的純中藥復方靜脈注射液，臨床上具有清熱利濕、疏肝退黃的效果[2-3]，主要用于因濕熱內蘊引起的黃疸型病毒性肝炎的治療。本研究采用UPLC-MS/MS技術對苦黃注射液的有效成分進行質量控制，并模擬臨床用藥對其成品輸液進行穩定性考察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

UPLC色譜儀(配有30型二元高壓梯度泵、1100型柱溫箱、1100型自動進樣器，日本島津)，STQ5500型串聯四級桿線性離子肼質譜儀(電噴霧離子化源和三重四級桿線性離子肼串聯質量分析器，美國AB公司)，電子分析天平(精密度0.000 1 g，美國梅特勒公司)，KQ2700型120 W超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

苦參堿(批號：20161214)、槐國堿(批號：20170223)、大黃素(批號：20170412)、大黃酸(批號：20161223)、蘆薈大黃素(批號：20170212)、柴胡皂苷a(批號：20170126)均購自國家食品藥品檢定研究院。苦黃注射液(批號：1610231、1702281、1706141，常熟雷允上制藥有限公司)，甲醇、甲酸為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1液相色譜條件

色譜柱為Diamonsil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，柱溫為26 ℃，流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸緩沖溶液(B)，梯度洗脫(0～3.5 min，22%～51%A；3.5～5.0 min，51%～74%A；5.0～8.0 min，74%～94%A；8.0～11.0 min，94%～94%A)，流速為1.0 ml/min，進樣量為10 μl。

1.2.2質譜條件

ESI源，源噴射電壓為4 500～5 500 V；離子源溫度為600 ℃，霧化氣壓力為4.15×105Pa，加熱氣壓力為4.50×105Pa，工作模式為多反應監測模式(MRM)。正負離子同時進行檢測監測。苦參堿、槐國堿、蘆薈大黃素采用ESI+監測，大黃酸、大黃素、柴胡皂苷a采用ESI-監測。

1.2.3混合對照品溶液的配制[4]

分別精密稱取苦參堿、槐國堿、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、柴胡皂苷a對照品適量，分別置于5 ml容量瓶中，甲醇溶液溶解，定容至刻度，搖勻，即得各組分單一對照品溶液。精密量取上述單一對照品溶液各適量，置于同一5 ml容量瓶中，甲醇溶液稀釋，定容至刻度，搖勻，即可得到苦參堿80 ng/ml、槐國堿70 ng/ml、大黃素10 ng/ml、大黃酸168 ng/ml、蘆薈大黃素391 ng/ml、柴胡皂苷a 95 ng/ml的混合對照品溶液，采用流動相逐級進行稀釋為不同質量濃度的混合對照品溶液，置于冰箱中(2～8℃)儲存備用。

1.2.4供試品溶液的配制[5]

分別精密量取不同批號的苦黃注射液1 ml置于10 ml容量瓶中，加入甲醇-水(1∶1，V/V)溶液稀釋定容，過0.45 μm微孔濾膜，即可得到稀釋10倍的苦黃注射液，用于蘆薈大黃素和柴胡皂苷a的測定。將前述稀釋10倍的苦黃注射液繼續用甲醇-水(1∶1，V/V)溶液稀釋，得到稀釋4 000倍的苦黃注射液供試品，用于苦參堿、槐國堿、大黃素和大黃酸的測定。

2 結果

2.1 含量測定

2.1.1線性關系考察

將“1.2.3”項下的混合對照品溶液按照“1.2”項下的UPLC-MS/MS條件進樣分析，以對照品進樣質量濃度為橫坐標(X)、峰面積積分值為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程：

苦參堿：Y=3.75×105X+6.94×104，

r=0.999 7；

槐國堿：Y=2.14×105X+1.85×104，

r=0.999 4；

大黃素：Y=1.09×106X+4.32×104，

r=0.999 6；

大黃酸：Y=4.39×104X+2.24×105，

r=0.999 1；

蘆薈大黃素：Y=1.87×104X+2.61×104，

r=0.999 4；

柴胡皂苷a:Y=4.37×105X+1.14×104，

r=0.999 4。

結果表明，苦參堿、槐國堿、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、柴胡皂苷a分別在1.25～80.21、1.12～71.23、0.15～10.45、2.54～168.74、6.12～392.56、1.49～95.02 ng/ml范圍內線性關系良好。

2.1.2精密度試驗

取同一批次苦黃注射液按照“1.2.4”項下制備得到稀釋10倍的供試品溶液和稀釋4 000倍的供試品溶液各6份，按照“1.2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄6種成分的色譜峰面積，計算RSD值，分別為1.02%、0.98%、1.01%、1.10%、0.99%、1.08%，表明儀器的精密度較好。

2.1.3重復性試驗

取同批次苦黃注射液，按照“1.2.4”項下的制備方法配制稀釋10倍和稀釋4 000倍的供試品溶液各6份，分別按照“1.2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄6種成分的色譜峰面積，計算含量。苦參堿、槐國堿、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、柴胡皂苷a的平均含量分別為198.74、114.12、2.44、100.37、2.21、0.021 μg/ml，RSD分別為2.14%、1.98%、2.02%、2.14%、2.17%、1.99%，表明該方法重復性良好。

2.1.4加樣回收率試驗

取同一批次的苦黃注射液，分別加入6種有效成分的2種不同濃度，按照“1.2.4”項下的供試品溶液制備稀釋10倍的溶液后，按照“1.2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算平均加樣回收率，結果如表1所示。

表1 苦黃注射液加樣回收率試驗結果(n=4)

2.1.5樣品含量測定

取批號161023、170228、170614的3批次苦黃注射液，按照“1.2.4”供試品制備的步驟進行稀釋配制后，按照“1.2.1”項下的色譜條件進行含量測定，結果如表2所示。

表2 樣品有效成分含量測定結果(ρB/μg·ml-1，n=3)

2.2 苦黃注射液成品輸液穩定性考察

模擬臨床用藥的濃度以及輸液條件，于靜脈用藥配制中心由專業的藥學人員在水平層流型潔凈工作臺上取苦黃注射液3支(每支10 ml)，分別加入5%葡萄糖注射液250 ml、10%葡萄糖注射液250 ml，果糖注射液250 ml中，即可得到高濃度苦黃注射液成品輸液；再取苦黃注射液3支(每支5 ml)，分別加入5%葡萄糖注射液250 ml、10%葡萄糖注射液250 ml、果糖注射液250 ml即可得到低濃度苦黃注射液成品輸液。對于最大劑量、最小劑量的苦黃成品輸液按照2015年版《中華人民共和國藥典》中的規定和相關檢測方法[4]，分別在室內光照(照度4 500 lx)下、遮光條件下室溫放置36 h，并在0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、20、24、30、36 h對其進行外觀、可見異物、含量、pH值以及不溶性微粒的檢測。結果：①各個成品輸液在36 h均澄清，無明顯的混濁和沉淀產生，顏色無明顯的變化，為深黃色的澄清溶液。②低濃度室內光照的10%葡萄糖注射液的成品輸液pH在6 h后顯著升高；高濃度組5%葡萄糖注射液與10%葡萄糖注射液的成品輸液pH值呈下降的趨勢，低濃度組5%葡萄糖注射液的pH值則略微升高，遮光條件下保存的成品溶液穩定性比光照條件下的好；果糖注射液的成品輸液呈中性。③除高濃度時，果糖注射液的成品輸液24 h后的微粒值不符合規定，其余各個濃度組的微粒值在36 h內均符合規定，結果如表3所示。

3 討論

3.1 樣品的處理方式以及離子化模式的確定

在對苦黃注射液多組分成分進行測定時，其中的苦參堿、槐國堿、蘆薈大黃素在正離子模式下的響應值較好，大黃酸、大黃素、柴胡皂苷a在負離子模式下的響應值最好[5-7]。在離子掃描結果中，苦參堿、槐國堿為苦參型生物堿逐步開環裂解，分別產生子離子。

表3 3種苦黃成品輸液的穩定性

因此，采用正負離子同時監測的模式，可以在同一分析周期內對苦黃注射液中的6種有效成分進行LC-MS/MS檢測，為中藥苦黃注射液的質量控制提供有效的實驗參考數據[8-9]，大大縮短了分析的時間，提高了分析檢測的效率。

3.2 成品輸液中溶媒的確定以及穩定性

中藥注射劑在給患者輸液過程中常常會出現不良反應事件[10]，臨床一般按照說明書選擇5%葡萄糖注射液或者10%葡萄糖注射液作為苦黃注射液的溶媒，但不宜使用0.9%氯化鈉注射液作為溶媒，主要原因是苦黃注射液一旦加入電解質會發生鹽析作用，產生微粒或沉淀，因此，本研究不選擇0.9%氯化鈉注射液，而選擇5%葡萄糖注射液和10%葡萄糖注射液[11-12]，并對兩者進行外觀、可見異物、含量、pH值以及不溶性微粒的檢測，結果表明，除光照條件下pH值有不同程度的增加之外，其余質量指標均符合合格標準。

本研究還選擇了果糖注射液為溶媒進行配伍穩定性研究，考察糖尿病患者是否可以用果糖注射液代替葡萄糖注射液作為溶媒，以便為糖尿病患者的合理用藥提供有價值的數據支持[13-15]。苦黃注射液及其成品輸液在儲存過程中對光照穩定性差，并且在最大劑量組中果糖注射液的成品輸液24 h后微粒值不符合規定，在臨床使用時，應注意上述引起質量變化的不穩定因素，以達到最大程度的安全治療。