HPLC法測定人血漿中伏立康唑及其代謝物的濃度

王志君，楊云云，張文靜，王學(xué)彬，宋洪杰，王 卓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

伏立康唑(voriconazole)為三唑類廣譜抗真菌藥，2004年被FDA批準(zhǔn)為曲霉菌或念珠菌血癥的首選藥物。其抑制麥角甾醇的合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性異常，促使真菌細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗真菌效應(yīng)[1]。與其他三唑類抗真菌藥相比，伏立康唑是一種耐受性良好的藥物，但有肝毒性、神經(jīng)毒性，同時(shí)伏立康唑的藥動學(xué)個體間差異很大，主要原因是人體內(nèi)的代謝酶CYP2C19具有遺傳多態(tài)性，特別是亞洲人中弱代謝者的發(fā)生率高達(dá)15%～20%，同時(shí)患者自身的疾病狀態(tài)或合并用藥可能增加伏立康唑代謝的差異[2-7]。因此，對伏立康唑及其主要代謝物伏立康唑氮氧化物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測具有臨床意義。目前，用于伏立康唑血藥濃度測定的方法主要包括微生物檢測法、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法、高效液相色譜-熒光檢測法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]，考慮到臨床應(yīng)用的實(shí)用性和可行性，本研究建立了樣品沉淀蛋白，并用HPLC-UV測定的方法，使其具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的特點(diǎn)，并可以同時(shí)測定伏立康唑及其氮氧化物，以便用于日常治療藥物監(jiān)測(TDM)和個體化給藥調(diào)整。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測器、SIL-20AC自動進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱日本島津公司)；C18-AR色譜柱(ACE 150 mm×4.6 mm，柱號：V12-6682)；XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；離心機(jī)(Eppendorf AG 22331 Hamburg 5452ZR858343)；SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DL-180A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；1.5 ml微型離心管(EP管)。

1.2 藥品與試劑

伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品食品檢定研究院，批號：100862-201402，含量 99.2%)；罌粟堿(Cayman CHEMICAL 公司，批號：0476735-1，含量≥98%)；伏立康唑氮氧化物(Toronto Research Chemicals公司，批號：7-dpm-64-3，含量97%)；甲醇、乙腈(色譜純)、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉(分析純，上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司)；空白人血漿(長海醫(yī)院血庫)。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

LcSolution版本1.26 SP1(日本島津公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱ACE 5 C18-AR(150 mm×4.6 mm，柱號：V12-6682)，以0.025 mol/L磷酸二氫鈉(含三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L的氫氧化鈉調(diào)至pH為7.0)-乙腈(67∶33)為流動相，檢測波長：255、276 nm(雙波長檢測)，流速：1.0 ml/min，自動進(jìn)樣器溫度：4 ℃，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液

精密稱取伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)品、伏立康唑氮氧化物標(biāo)準(zhǔn)品適量，置50 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即得400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，備用。

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取罌粟堿適量置100 ml棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得濃度為100 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液；取內(nèi)標(biāo)儲備液5 ml置100 ml棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得濃度為5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，置2～8 ℃冰箱冷藏保存，備用。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理

取血漿0.3 ml于1.5 ml的EP管中，再加乙腈至1.2 ml，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進(jìn)樣分析。

2.4 方法專屬性試驗(yàn)

分別取空白血漿、加入內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、加入伏立康唑和伏立康唑氮氧化物及內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿、使用伏立康唑的患者血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行前處理，按“2.1”項(xiàng)下方法檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)伏立康唑氮氧化物、罌粟堿、伏立康唑保留時(shí)間分別為4.5、11.3、13.7 min，各峰分離度均大于2，理論塔板數(shù)均大于1 000，空白血漿和流動相中干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，結(jié)果見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

取空白血漿及伏立康唑和伏立康唑氮氧化物儲備液以及罌粟堿儲備液，將伏立康唑和伏立康唑氮氧化物濃度分別配制為0.5、1、2、5、10、15、20 μg/m1，內(nèi)標(biāo)罌粟堿濃度調(diào)為3.75 μg/m1的混合血漿樣品。按“2.3”項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以伏立康唑氮氧化物和罌粟堿面積的比值(F1)對血漿濃度(C1)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù)：1/C)，得回歸方程為：F1=0.111 1 C1+0.020 0，r=0.999 5；以伏立康唑和罌粟堿面積的比值(F2)對血漿濃度(C2)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重系數(shù)：1/C)，得回歸方程為：F2=0.070 74C2-0.038 60，r=0.999 5。結(jié)果表明，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在0.5～20.0 μg/m1濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。定量限濃度為0.2 μg/ml(S/N>10)。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

2.6.1批內(nèi)回收率和精密度

分別配制定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的質(zhì)控(QC)血漿樣品，每個濃度取5個樣本，按“2.3”項(xiàng)方法操作，測定。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定QC樣品的相對回收率，伏立康唑：101.3%、103.8%、94.2%、91.7%(RSD分別為6.2%、4.4%、4.7%、1.4%，n=5)，伏立康唑氮氧化物：106.8%、100.1%、94.3%、91.6%(RSD分別為6.2%、4.8%、4.7%、2.1%，n=5)。

2.6.2批間回收率和精密度

分別配制3批的定量下限及低、中、高濃度樣品(0.5、1、5、15 μg/m1)的QC血漿樣品，每個濃度取5個樣本，按“2.3”項(xiàng)方法操作，分3 d進(jìn)行測定，測定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的回收率，伏立康唑：97.9%、99.6%、102.6%、101.6%(RSD分別為9.2%、5.9%、3.3%、3.6%)，伏立康唑氮氧化物：100.9%、100.0%、97.3%、98.7%(RSD分別為9.3%、6.4%、5.9%、6.7%)。

圖1 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的專屬性色譜圖 A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C.空白血漿+伏立康唑?qū)φ掌?伏立康唑氮氧化物對照品+內(nèi)標(biāo)；D.患者血漿+內(nèi)標(biāo) 1.伏立康唑氮氧化物；2.伏立康唑；3.罌粟堿

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1工作溶液

取伏立康唑和伏立康唑氮氧化物乙腈溶液，配成0.5、2.0、15 μg/m1濃度系列，以及罌粟堿乙腈溶液1.0 μg/m1,按“2.1”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣，分別于日內(nèi)和日間進(jìn)樣測定，計(jì)算日內(nèi)和日間誤差。結(jié)果顯示,伏立康唑日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測得濃度的RSD分別為1.6%和1.2%；伏立康唑氮氧化物日內(nèi)(0、2、4、6、8 h)和日間(3 d)測得濃度RSD分別為1.5%和2.0%；罌粟堿測得濃度RSD為1.5%。伏立康唑、罌粟堿和伏立康唑氮氧化物的乙腈溶液3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.2血漿樣品

制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低、高濃度(含伏立康唑氮氧化物和罌粟堿)的血漿樣品，分別進(jìn)行：①反復(fù)3次凍融 (-20～25℃)穩(wěn)定性試驗(yàn)；②含藥血漿樣品(-20℃)放置1個月穩(wěn)定性試驗(yàn)；③血漿樣品處理后48 h穩(wěn)定性試驗(yàn)；④血漿樣品自動進(jìn)樣器中(4℃)放置24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)；⑤樣品常溫放置24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“2.3”項(xiàng)方法操作，每個濃度取5個樣本，測定結(jié)果的峰面積代入相應(yīng)的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算準(zhǔn)確度。結(jié)果由表1可見：血漿樣品反復(fù)凍融3次后穩(wěn)定性良好；血漿樣品在-20℃條件下至少可以保存1個月；血漿樣品處理后可在室溫下保存48 h；處理后的血漿樣品在自動進(jìn)樣器中(4℃)、室溫中至少可保存48 h。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5，%)

2.8 臨床標(biāo)本測定應(yīng)用

取血液科服用伏立康唑(同時(shí)服用環(huán)孢素A)的臨床患者的血液樣品(采用EDTA抗凝管，取血量2～3 m1)，3 000 r/min離心5 min，取血漿300 μl，加5 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液至1 200 μl，渦旋振蕩0.5 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液20 μl進(jìn)樣分析，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。10例患者中，伏立康唑血藥濃度在0.49～5.2 μg/m1；伏立康唑氮氧化物血藥濃度在0.43～5.5 μg/m1；伏立康唑血藥濃度/伏立康唑氮氧化物血藥濃度的比值在0.63～20之間。在本研究過程中1名患者使用伏立康唑后，臨床醫(yī)生根據(jù)其血液樣品監(jiān)測結(jié)果對患者進(jìn)行2次給藥方案調(diào)整，最終使伏立康唑血藥谷濃度在有效濃度范圍內(nèi)(1～5 μg/m1)，具體監(jiān)測結(jié)果見表2。在此過程中，通過TDM監(jiān)測，臨床醫(yī)生及時(shí)調(diào)整給藥方案，避免低效治療并降低發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

表2 患者血藥濃度監(jiān)測結(jié)果(ρB/μg·ml-1)

3 討論

3.1 檢測指標(biāo)成分的選擇

伏立康唑主要在肝臟通過CYP450的同工酶CYP2C19代謝，主要代謝產(chǎn)物為無抗菌活性的伏立康唑氮氧化物，血漿中約占72%。CYP2C19酶呈基因多態(tài)性，其在不同人種、不同基因型患者的伏立康唑代謝具有明顯差異。在給予相同劑量伏立康唑后，因代謝的明顯差異，導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度變化較為明顯，從而引起治療效果不佳或者不良反應(yīng)增加。本研究擬考察伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的濃度來提高治療效果，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。同時(shí)為下一步擬合CYP2C19酶多態(tài)性及伏立康唑、伏立康唑氮氧化物濃度的關(guān)系提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.2 流動相的選擇

伏立康唑是三唑類化合物，采用甲醇-乙腈溶劑系統(tǒng)流動相，干擾現(xiàn)象比較嚴(yán)重，在流動相中加入適量鹽和三乙胺可抑制其拖尾，改善峰形。本研究曾分別考察了加入不同比例三乙胺、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值對峰形的影響。發(fā)現(xiàn)0.025 mol/L磷酸二氫鈉(三乙胺400 μl/L，用0.25 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH=7.0)-乙腈(67∶33)作為流動相時(shí)，峰形對稱，分離效果較好，檢測時(shí)間適宜，從而選擇其作為流動相。

3.3 提取溶媒的選擇

本研究采用以乙腈為沉淀劑的蛋白沉淀法處理血液樣品。采用此方法時(shí)，干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，按照《中國藥典》四部通則9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，可作為提取方法。

3.4 檢測波長的選擇

255 nm、276 nm分別為伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最大吸收波長，在測定部分患者血液樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)：檢測波長為276 nm時(shí)，伏立康唑氮氧化物的干擾小，測定準(zhǔn)確性好；檢測波長為255 nm時(shí)，伏立康唑的響應(yīng)值高，精密性好，所以選擇雙波長檢測。

3.5 臨床標(biāo)本的測定

由于血液科用藥品種多，用藥方案多變，本研究采用常見的環(huán)孢素A+伏立康唑的患者作為對象，文獻(xiàn)報(bào)道[12]：環(huán)孢素A和伏立康唑具有相互作用，伏立康唑影響環(huán)孢素A的血藥濃度，同時(shí)兩者均有肝毒性，本研究擬通過監(jiān)測患者(同時(shí)使用環(huán)孢素A藥物)伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的血藥濃度，為個體化給藥方案提供數(shù)據(jù)支持，為降低血液科患者這一特殊人群發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)做前期的研究準(zhǔn)備工作。