多重連接依賴的探針擴增檢測Rett綜合征患兒大片段缺失

張曉英

【摘要】目的：篩查Rett 綜合征（Rett syndrome， RTT）患兒甲基化CpG結合蛋白2（methyl-CpG-binding protein2，MECP2）基因大片段缺失及重復。方法：采用多重連接依賴的探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification， MLPA）方法對88例確診RTT（PCR及測序未見MECP2突變）患兒進行此基因突變分析。結果：MECP2大片段缺失的突變篩出率為11%，除外1例非典型RTT，其余均為典型RTT，且9例涉及第3和/或第4外顯子。結論：MLPA作為MECP2篩查的重要補充，典型及非典型患兒都應進行。

【關鍵詞】多重連接依賴的探針擴增;Rett 綜合征

【中圖分類號】R729【文獻標識碼】【文章編號】2095-6851（2019）02-249-01

近年來多重連接依賴的探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification， MLPA）技術廣泛應用于基因檢測、基因診斷等多個領域[1-3]。Rett綜合征（ Rett syndrome ， RTT）是一種嚴重影響兒童精神運動發育的X連鎖顯性神經遺傳病，其主要的致病基因為甲基化CpG結合蛋白2（methyl-CpG-binding protein2，MECP2）[4-5]，MECP2大片段缺失等復雜重排約占基因突變總數的6～23 %[6-8]。本文對88例PCR及測序未見MECP2突變的患兒行MLPA，研究其基因突變特點，為臨床診斷提供重要實驗室依據。

1對象和方法

1.1對象PCR及直接測序方法沒有檢測到MECP2突變的患兒88例，均符合RTT的診斷標準[9]，包括典型RTT 67例，非典型RTT 21例。年齡1歲5月～16歲，中位數3歲，均為女性。患兒家長均簽署知情同意書，并填寫患兒臨床資料調查表。

1.2方法

1.2.1DNA純化取患兒及其父母外周靜脈抗凝血 5～ 10 mL提取DNA（蛋白酶K-氯化鈉鹽析法）[10]。選用北京天根生化科技有限公司生產的DNA純化試劑盒對DNA進行純化，按照試劑盒具體步驟進行DNA純化。

1.2.2 MLPA進行MECP2突變分析 3μL 純化的DNA加入0.2mL EP管放置在PCR儀（Eppendorf公司，德國）98°C變性5分鐘后，降溫至25°C加入1.5μL的混合液（0.75μL probemix+0.75μL MLPA buffer），95°C 反應1分鐘后降溫至60°C孵育16～18小時。溫度降至54°C時加入16μL連接反應混合液（1.5μL Ligase-65 buffer A、1.5μL Ligase-65 buffer B、0.5μL Ligase-65 和12.5μL去離子水），混勻。54°C孵育15分鐘進行連接反應，98°C 5分鐘滅活連接酶后降溫至20°C，加入5μL PCR混合液（1μL SALSA 引物、0.25μL SALSA聚合酶和3.75μL 去離子水）混勻后進行PCR反應。95°C 反應5分鐘后，95°C 變性45秒，60°C 退火30秒，72°C延伸1分鐘，共35個循環，最終72°C延伸5分鐘。所用試劑盒P015E1由荷蘭MRC-Holland公司生產。

擴增后的PCR產物用DNA測序儀ABI3310（Applied Biosystems， Foster， USA）進行MECP2突變分析，最終所得數據用GeneMarker軟件進行分析。以被測樣品與對照組的峰值進行比較，比值為1示基因劑量無變異，比值小于0.70以下提示基因缺失，比值大于1.3提示基因重復。

2結果

對88例患兒進行MLPA分析， 發現10例（包括9例典型RTT及1例非典型RTT）大片段缺失，約占其總數11 % （10/88）。大片段缺失的患兒中9例（90%，9/10）涉及外顯子3和/或4，僅1例（10%，1/10）涉及第一外顯子，表1。

3討論

2002年荷蘭科學家Schouten等[11]最先報道了MLPA技術，其將核酸的雜交檢測和PCR鏈式擴增相結合。至今已發展為一種核酸檢測技術，廣泛應用于科研及臨床。MLPA主要包括探針與DNA樣本的雜交、連接和擴增三個關鍵的步驟，通過設計的專一探針組可粘合至目標序列。若完全粘合，則連接酶會將兩條探針連接為片段。然后利用通用引物組進行PCR反應，將連接片段擴增。若目標序列缺失或發生突變，則兩條探針無法連接成功，即不會產生相應擴增產物。通用引物擴增連接好的探針，每個探針的擴增產物長度都是唯一的，擴增產物可以通過毛細管電泳分離對結果進行分析。MLPA實現靶分子的高效特異性分析，其核心技術是合成序列特異的長探針和短探針。RTT作為女性智力低下最常見的病因之一，根據臨床表現可分為典型和不典型病例[9]。MECP2突變為RTT主要的致病基因[4-5]，目前已發現的MECP2突變達500多種（http;//mecp2.chw.edu.au），先前報道MLPA發現 MECP2大片段缺失及復雜重排約占總突變病例的6～23% [6-8]。Scala等[12]對77例測序未見MECP2突變RTT患兒（33例典型患兒，31例非典型及13例RTT樣患兒）進行MLPA突變分析，結果發現16例（21%，16/77）MECP2大片段缺失，包括15例（45%，15/33）典型患兒及1例（3%，1/31）非典型患兒。其中2例（13%，2/16）涉及第1、第2外顯子缺失，其余14例（88%，14/16）均涉及第3、第4外顯子缺失。Hardwick等[13]在149例測序未見MECP2突變患兒中僅發現12例（8%，12/149）大片段缺失患兒，其中5例（50%，5/10）是典型患兒，5例（50%，5/10）非典型RTT，還有1例先天性腦病患兒;12例患兒中11例（92%，11/12）涉及第3、第4外顯子缺失。本研究對88例測序未見MECP2突變RTT患兒行MLPA篩查基因有無大片段缺失及重復，結果發現10例大片段缺失患兒，MLPA篩出率約11%。其中9例為典型患兒，僅1例為非典型RTT。大片段缺失的患兒中90%（9例，9/10）均涉及外顯子3和/或4，僅1例（10%，1/10）涉及外顯子1和2（del 1～2）。結果與Scala等及Hardwick等報道相似，典型RTT和非典型RTT患兒都可見MECP2大片段缺，且缺失區域主要涉及第3和/或第4外顯子。國外有研究表明[14] MECP2在3 到TRD有一個高度重復區域（deletion prone region， DPR），C-末端發生基因內缺失的斷點常常位于此區域，而C-末端突變影響轉錄調控過程中MECP2與DNA結合能力。本研究中9例大片段缺失涉及DPR，且這些突變與上述報道相似[14]。此外，國外已有數例MECP2重復突變報道[15-17]，但本次篩查未見基因重復。

本研究對88例測序未見MECP2突變RTT患兒行MLPA篩查，結果顯示10例大片段缺失患兒中90%為典型患兒，且90%均涉及外顯子3和/或4。MECP2作為RTT患兒的主要致病基因，測序等未見突變患兒應行MLPA篩查患兒有無大片段缺失及復雜重排等基因突變，且典型及非典型患兒都應進行篩查，為臨床診斷提供重要支持。

參考文獻：

[1]Kim DH， Cho CH， Kwon SY， et al. BRCA1/2 mutations， including large genomic rearrangements， among unselected ovarian cancer patients in Korea[J]. J Gynecol Oncol. 2018， 29（6）：e90.

[2]Grieco GS， Gagliardi S， Ricca I， et al. New CACNA1A deletions are associated to migraine phenotypes.[J]. J Headache Pain. 2018， 19（1）：75.

[3]Ceroni JRM， Dutra RL， Honjo RS， et al. A Multicentric Brazilian Investigative Study of Copy Number Variations in Patients with Congenital Anomalies and Intellectual Disability.[J]. Sci Rep. 2018， 8（1）：13382.

[4]Lyst MJ， Ekiert R， Guy J， et al. Affinity for DNA Contributes to NLS Independent Nuclear Localization of MeCP2[J]. Cell Rep. 2018， 24（9）：2213-2220.

[5]Raman AT， Pohodich AE， Wan YW， et al. Apparent bias toward long gene misregulation in MeCP2 syndromes disappears after controlling for baseline variations[J]. Nat Commun. 2018， 9（1）：3225.

[6]Philippe C， Villard L， De Roux N， et al. Spectrum and distribution of MECP2 mutations in 424 Rett syndrome patients： a molecular update[J]. Eur J Med Genet. 2006， 49（1）：9-18.

[7]Hardwick SA， Reuter K， Williamson SL， et al. Delineation of large deletions of the MECP2 gene in Rett syndrome patients， including a familial case with a male proband[J]. Eur J Hum Genet. 2007， 15（12）：1218-1229.

[8]Todorov T， Todorova A， Motoescu C， et al. Spontaneous recurrent mutations and a complex rearrangement in the MECP2 gene in the light of current models of mutagenesis[J]. Mutat Res. 2012， 734（1-2）：69-72.

[9]Hagberg B， Hanefeld F， Percy A， et a1. An update on clinically applicable diagnostic criteria in Rett syndrome. Eur J Paediatr Neurol， 2002， 6： 293-297.

[10]姜勝玲，包新華，宋福英，等. Rett綜合征X染色體失活方式及失活X染色體起源研究. 2006： 44， 648-652

[11]Schouten JP， McElgunn CJ， Waaijer R， et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification[J]. Nucleic Acids Res. 2002， 30（12）：e57.

[12]Scala E， Longo I， Ottimo F， et al. MECP2 deletions and genotype-phenotype correlation in Rett syndrome[J]. Am J Med Genet A. 2007， 143A（23）：2775-2784.

[13]Hardwick SA， Reuter K， Williamson SL， et al. Delineation of large deletions of the MECP2 gene in Rett syndrome patients， including a familial case with a male proband[J]. Eur J Hum Genet. 2007， 15（12）：1218-1229.

[14]Miltenberger-Miltenyi G， Laccone F. Mutations and polymorphisms in the human methyl CpG-binding protein MECP2. Hum Mutat. 2003， 22（2）： 107-115.

[15]Ariani F， Mari F， Pescucci C， et al. Real-time quantitative PCR as a routine method for screening large rearrangements in Rett syndrome： Report of one case of MECP2 deletion and one case of MECP2 duplication. Hum Mutat. 2004， 24（2）： 172-177.

[16]Meins M， Lehmann J， Gerresheim F， et al. Submicroscopic duplication in Xq28 causes increased expression of the MECP2 gene in a boy with severe mental retardation and features of Rett syndrome. J Med Genet. 2005， 42（2）： e12.

[17]Friez M J， Jones J R， Clarkson K， et al. Recurrent infections， hypotonia， and mental retardation caused by duplication of MECP2 and adjacent region in Xq28. Pediatrics. 2006， 118（6）： e1687-e1695.