微流控芯片中亞硝酸鹽的圖像分析方法研究

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(1.安徽理工大學,安徽淮南 232000; 2.浙江清華長三角研究院分析測試中心,浙江嘉興 314006; 3.國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心,浙江嘉興 314006)

亞硝酸鹽不僅能抑制微生物的生長和繁殖,并且能對食品進行保鮮。然而,有研究發現,亞硝酸鹽不僅具有致癌性,而且與人類先天畸變有關系[1-2];人體血液中亞硝酸鹽濃度為0.4～200 mg/kg時會產生毒性,1 g亞硝酸鹽即可致人死亡[3]。因此,針對食品中亞硝酸鹽的含量,我國制定了許多嚴格的檢測標準[4-5]。

目前用于亞硝酸鹽的檢測方法主要分為兩大類,一類是傳統的精密儀器檢測分析方法,主要包括色譜-質譜聯用法、離子色譜法、電化學方法等[6-8];另一類是現場快速檢測方法,主要為比色法、分光光度法等[9-10]。精密儀器分析方法雖然精度高、靈敏度高,但操作繁瑣,設備昂貴,需要專業人員操作,無法滿足對亞硝酸鹽進行現場、快速、微量化、便攜化的檢測需要[11]。現場快速檢測方法中的比色法主要采用試劑盒顯色反應后,檢測者將反應后的溶液顏色與標準比色卡進行人眼判讀,從而快速獲得定性分析結果,這種方法雖然成本低、操作方便、檢測時間短,但準確度低、誤差大[12-13];分光光度法主要使用分光光度計對顯色反應后的溶液直接進行定量分析,但操作步驟繁瑣,需要現場配制及多次移取溶液,而且需要專業人員進行操作[13-14]。因此,研究更加簡便、快速、準確的亞硝酸鹽測定方法具有一定的實際需求。

近年來,基于紙基微流控芯片和圖像分析技術的快速檢測方法[15-17],已被用于生化顯色反應結果的快速定量檢測。例如,趙聯朝[15]等開發了一種用于亞硝酸根離子檢測的過氯乙烯樹脂紙基微流控芯片,采用Photoshop軟件計算紙基微流控芯片上的顯色強度,實現了水樣和食品中亞硝酸根離子測定;肖良品[16]等提出使用中性濾紙為基材的三維紙芯片,結合自制的比色檢測裝置,采用Photoshop軟件檢測自來水中的亞硝酸鹽。上述方法不僅試劑用量少,而且分析速度快、成本低、操作簡單,可實現一定濃度范圍內亞硝酸鹽的快速定量分析。然而在圖像分析過程中,紙基微流控芯片中容易受濾紙或高分子膜的形貌及材料本體顏色的干擾[11,18]導致檢測結果誤差較大。

本文提出一種基于微流控芯片液相反應[19-20]結合圖像分析技術的亞硝酸鹽檢測方法。通過微泵驅動待測溶液在具有二級串聯式通道的微流控芯片中,依次與預先固定于芯片內部的兩種試劑發生化學顯色反應;使用自行搭建的圖像采集平臺對微量反應池的封閉溶液進行圖像采集,基于OpenCV(計算機視覺庫)圖像庫中的處理方法,建立圖像處理的方法和步驟,計算獲得亞硝酸鹽顯色溶液的相對灰度值[21],從而定量分析亞硝酸鹽濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸 上海士峰生物科技有限公司;36%鹽酸 國藥集團;亞硝酸鈉 山東西亞化學工業有限公司;杭州當地市售臘肉;光學級聚甲基丙烯酸甲酯板材(PMMA) 蘇州揚清芯片科技有限公司。

U-2900型紫外可見分光光度計 日立公司;JA1203B型電子天平 上海精科實業有限公司;KFSHAA2B03G型蠕動泵 卡川爾流體科技有限公司;RER-USB8MP02G型攝像頭 深圳市銳爾威視科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 亞硝酸鈉標準溶液:準確稱取0.01 g亞硝酸鈉,溶解定容至10 mL,配制成1 g/L的亞硝酸鹽溶液作為母液。實驗中待測標準溶液依此母液稀釋而成。20%鹽酸溶液:量取36%的鹽酸10 mL,稀釋定容至18 mL。亞硝酸鹽檢測試劑Ⅰ:稱取0.1 g對氨基苯磺酸,溶于20%鹽酸中,并用此鹽酸定容至10 mL;亞硝酸鹽檢測試劑Ⅱ:稱取0.08 g鹽酸萘乙二胺,加入蒸餾水,溶解定容至10 mL。實驗中所用水均為蒸餾水。

1.2.2 檢測原理 待測溶液中的亞硝酸鹽依次與試劑Ⅰ、試劑Ⅱ充分反應后,生成玫瑰紅溶液,可以通過溶液的顏色深淺來表征亞硝酸鹽濃度[22-23]。實驗過程為:首先在芯片上進行亞硝酸鹽的顯色反應;將充分反應后的芯片放入檢測裝置中,啟動圖像采集系統;對采集到的圖像進行處理,計算顯色反應池內的平均灰度值。根據標準亞硝酸鹽顯色溶液的平均灰度值與亞硝酸鹽濃度,獲得濃度標準曲線,為定量檢測食品中亞硝酸鹽的含量提供技術保證和理論依據。

1.2.3 微流控芯片結構與反應流程 本文所采用的PMMA微流控芯片厚度為3 mm,其中顯色反應池的深度為2 mm。芯片結構如圖1a所示,包括進樣口、初級反應池、顯色反應池和微泵接口。

芯片封裝前,采用凍干工藝[24]預先將10 μL的試劑Ⅰ和10 μL試劑Ⅱ分別存儲到微流控芯片的初級反應池和顯色反應池內。檢測時,首先通過微泵定量吸取150 μL待測樣品溶液于初級反應池內;充分反應后,再通過微泵將初級反應池內的溶液吸入到顯色反應池,自動進行化學顯色反應,如圖1b所示。

圖1 微流控芯片結構及進樣反應流程Fig.1 Structure of microfluidic chip and injection reaction flow

1.2.4 圖像采集平臺 光源及拍照環境對圖像質量以及后續圖像處理、分析影響較大,本文設計并搭建了用于提供光源的暗箱圖像采集裝置,如圖2所示,暗箱圖像采集裝置包括微流控芯片固定平臺、攝像頭及LED環形燈組。攝像頭安裝在芯片正上方,LED燈組安裝在攝像頭周圍環形均勻分布保證拍照光源的均一性。

圖2 圖像采集裝置結構Fig.2 Structure of image acquisition device

1.2.5 反應動力學 配制10 mg/L的亞硝酸鈉溶液作為待測液,使用微泵定量吸取150 μL待測液于初級反應池內,靜置反應一段時間,確保亞硝酸鹽與試劑I反應完全;再通過微泵將初級反應池內的溶液吸入到顯色反應池,調節分光光度計的檢測波長為540 nm[25],監測顯色反應池中吸光度隨時間的變化情況。

1.2.6 圖像分析方法 為了計算顯色反應池區域的相對灰度值,需要分割出背景區域與顯色反應池區域,本文基于Visual Studio 2012平臺和OpenCV圖像庫進行處理操作,運用灰度二值化處理、圖像形態學運算及圖像濾波等圖像處理方法,對背景區域與顯色反應池進行分割,分別計算背景圖像灰度值與顯色反應池區域灰度值,根據公式Gr=Gb-Gf計算相對灰度值,其中,Gr為相對灰度值,Gb為背景灰度值,Gf為前景灰度值。

1.2.7 系統考察

1.2.7.1 標準曲線的建立 配制濃度分別為0.5、2、4、6、8、10 mg/L的亞硝酸鈉溶液進行系統考察,按照圖像處理流程對顯色反應后的微流控芯片進行圖像采集及分析,以亞硝酸鈉溶液濃度為橫坐標,分析獲得的相對灰度值為縱坐標,進行線性擬合分析,繪制亞硝酸鈉的標準曲線,根據檢出限公式MDL=St(n-1,0.99)計算檢出限。

1.2.7.2 加標回收實驗 將市售臘肉切成約1 mm×1 mm的小碎片,用天平稱取2.0 g置于燒杯中,加入蒸餾水20 mL,浸泡10～15 min,取樣品上清液10 mL于離心管中,備用。

用本文方法對臘肉提取液做樣品加標回收實驗,對空白自來水溶液做空白加標回收實驗,臘肉提取液和自來水溶液分別測定3組樣品,每組測定6次,計算6次測量濃度結果的均值、回收率、標準偏差(SD)。

1.2.8 方法對比 分別考察文中方法、試劑盒結合分光光度計法[9]和試劑盒結合比色卡法[10]在試劑、檢測時間、樣品用量、試劑消耗量、準確性以及操作步驟六個指標,并將文中方法分別與試劑盒結合分光光度法、試劑盒結合比色卡法進行比較。

2 結果與分析

2.1 反應動力學考察

圖3a顯示了微流控芯片顯色反應池中亞硝酸鹽與試劑Ⅱ的反應動力學過程曲線,當待測液進入顯色反應池后,0～90 s時間內溶液吸光度不斷增大,表明顯色反應的快速進行;90～150 s時間內,溶液吸光度繼續增大,但增速緩慢,表明顯色反應接近終點;當反應時間大于150 s時,溶液的吸光度基本保持不變,表明顯色反應結束,因此本文選擇150 s作為檢測時間。

同時還發現,初級反應池內的反應時間對顯色反應穩定后的吸光度也有一定的影響,隨著初級反應池反應時間的增加,顯色反應池中的溶液吸光度逐漸增大,如圖3b所示,初級反應池內反應時間在30～210 s內時,溶液吸光度緩慢增大,在210 s后基本保持不變,為保證檢測結果的準確性,本文選擇初級反應池反應時間為210 s。

圖3 亞硝酸鈉反應動力學曲線Fig.3 Reaction kinetics curves of sodium nitrite

2.2 圖像處理分析

圖4a為微流控芯片的原始灰度圖片,可以看出芯片邊緣部分有背景光干擾,對顯色反應池的圖像分析將會產生較大影響。同時,考慮到芯片壁、非擴散區域的影響,需要對圖像進行分割。

首先通過OpenCV對圖像進行二值化處理。如圖4b所示,對原始灰度圖像進行提取,可以得到如圖4c所示的背景灰度圖像,背景灰度圖像并不包含微流控芯片和顯色反應池區域,可用于計算背景灰度值。經二值化處理后的圖像存在明顯的孤立點和細小線條,這些點和線條并不屬于顯色區域;圖像形態學的開運算可以消除孤立點與細小線條,并且在平滑較大的邊界并不明顯改變其面積,通過調用OpenCV中的圖像形態學運算函數對圖像進行開運算處理,處理后的二值圖像明顯去除了目標區域的孤立點和部分細小線條(圖4d)。

以二值圖像為掩膜,對原始灰度圖像進行提取,可以得到如圖4e所示的灰度圖像,由于圖像中明顯存在噪聲,需要進一步對圖像進行濾波處理。由于溶液顏色具有單一性,理論上溶液各處顏色相同,即灰度值相同,需要對該灰度值兩側的噪音進行濾波,本文選擇帶通濾波。

遍歷圖4e各像素點的灰度值,統計各灰度值(零灰度值除外)的像素點數量,選擇像素點數量處于峰值狀態時的灰度值,以此灰度值為中心,進行帶通濾波。多次實驗表明,濾波帶寬為5～9個灰度值時,計算結果相差不到0.3個灰度值,隨著濾波帶寬的增加,所提取到的顯色區域比較完整。本文所取濾波帶寬為9個灰度值,如圖4f所示,明顯去除了顯色區域的噪聲,可以用于計算顯色反應池的灰度值,根據背景灰度值和顯色反應池的灰度值計算相對灰度值。

圖4 圖像處理分析Fig.4 Image analysis with different treatments

2.3 標準曲線

圖5為亞硝酸鈉溶液的標準曲線,結果表明,擬合方程為y=8.2219x+4.6389,決定系數R2=0.9927,線形范圍在0.5～10 mg/L之間,檢出限為0.8 mg/L。

圖5 亞硝酸鈉溶液的標準曲線Fig.5 Standard curve of sodium nitrite solution

2.4 加標回收實驗

表1列出了不同樣品基質下的加標回收結果。未加標時,測得臘肉提取液的亞硝酸鹽濃度是1.89 mg/L。在不同的基質中,所測得的回收率在94.1%～108.0%之間,表明微流控芯片系統的準確度較好,因此,文中方法可以用來進行亞硝酸鹽的快速、準確檢測。

表1 加標回收實驗結果(n=6)Table 1 The results of recovery(n=6)

2.5 方法對比

表2為本文方法和傳統亞硝酸鹽快速檢測方法對比的結果。本文方法可直接將亞硝酸鹽檢測試劑預存儲于微流控芯片內部,無需現場配制溶液,只需簡單的人工操作即可實現。樣品消耗量約為分光光度法的1/4,試劑消耗量約為分光光度法的1/3;試劑消耗約為比色法的1/30,樣品用量約為比色法的1/24,可以滿足定量檢測亞硝酸鹽濃度的要求。相對于傳統的快速檢測方法,本文方法具有以下優點:基于微流控芯片的液相反應,保證化學顯色反應更為均一、穩定可控;樣品試劑消耗量少,檢測時間短;液相使用PMMA為芯片材料,芯片成本低、易于批量化生產。

表2 微流控技術和傳統亞硝酸鹽快速檢測方法對比Table 2 Comparison of microfluidic technology and traditional nitrite rapid detection method

3 結論

本文提出了一種基于圖像分析技術的微流控芯片中亞硝酸鹽快速檢測方法,實現了對亞硝酸鹽的低成本、快速、準確的檢測。采用自行搭建的拍照裝置結合圖像分析技術,自動截取并獲得微流控芯片中顯色區域的相對灰度值,實現了亞硝酸鹽的簡便、快速、準確的定量分析。實驗結果表明,亞硝酸鹽溶液在0.5～10 mg/L濃度范圍區間,所測顯色溶液的相對灰度值與亞硝酸鹽濃度呈線性關系,決定系數是0.9927,檢測限可達到0.8 mg/L,加標回收率在94.1%～108.0%之間,可用于食品中亞硝酸鹽的現場、低成本、快速、準確檢測。綜上所述,本文提出的方法具有穩定性好、操作簡單、反應時間短,適合非專業人員的操作,有望滿足基于化學顯色反應原理的檢測需求。