霍山石斛多糖的制備、功能和產品開發的研究進展

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(九仙尊霍山石斛股份有限公司,上海 201199)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseCZ. Tang et S.J. Cheng)是蘭科石斛屬多年生草本植物,又稱“米斛”,其莖入藥,是我國傳統醫藥中的一種名貴中藥材,產于安徽大別山的霍山及臨近地區[1]。藥用石斛種類繁多,但功效差別很大,傳統醫學認為霍山石斛是最道地、最為珍貴的石斛品種[2-4]。清代趙學敏《本草綱目拾遺》中明確、詳盡地闡釋了霍山石斛:“……系出六安州及穎州府霍山縣,名霍山石斛,最佳。形短只寸許,形如累米,嚼之微有漿、黏齒,有解暑醒脾,止渴利水,益人力氣的功效……”。這充分揭示了六安石斛與霍山石斛一脈相承的密切關系[5-6]?，F代研究亦表明,霍山石斛植株矮小,長3～9 cm,莖直立由下向上逐漸變細,呈圓錐狀,形似米粒,花呈淡黃綠色,明顯區別于鐵皮石斛、細莖石斛及其它石斛,具有獨特的地理分布、形態特征、遺傳結構及藥理活性[7-8]。

目前,香菇多糖、灰樹花多糖、肝素、云芝糖肽及硫酸酯多糖等多糖藥物和保健品,已成為當今生命科學研究和開發的熱點,被廣泛用于腫瘤、糖尿病、艾滋病、血栓等疾病的治療和防治[9]?，F代藥理和化學成分分析表明,霍山石斛中主要的活性成分是多糖類化合物,具有提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、保肝護胃及抗白內障等作用,其理化及結構特征與藥用活性密切相關[10-11]。從上個世紀五十年代開始,研究者相繼對霍山石斛多糖的提取純化、結構解析及功能活性等方面做了大量研究,并取得了一定的成果[12]。本文在查閱收集大量文獻基礎上,系統整理與歸納霍山石斛多糖的研究現狀,對多糖的分離純化、結構特征、生物活性及消化吸收進行綜述,并對相關專利及產品開發進行分析,為霍山石斛資源開發利用,保健食品、藥品開發提供參考和理論依據。

1 霍山石斛多糖的提取、分離純化

目前,霍山石斛的研究原料主要包括類原球莖、栽培莖和野生植株3類,在此基礎上對不同原材料中霍山石斛多糖提取、分離純化工藝及多糖含量變化規律進行系統研究。

1.1 霍山石斛原材料對多糖含量的影響

霍山石斛多糖含量與原材料、生長條件和提取方法等相關,不同器官組織、生長期、采收時期及不同種源植株中多糖含量差異顯著[13-15]。在霍山石斛的道地產區,仿野生栽培的霍山石斛,已逐漸替代野生石斛成為藥用霍山石斛的主要來源,實現了從試管苗或人工誘導種子萌發產生實生苗的大規模生產[16]。魏剛等[17]比較研究10批栽培的霍山石斛樣品的HPLC指紋圖譜,表明栽培的霍山石斛具有比較穩定的HPLC特征圖譜,其質量穩定,研究還分析了1批野生霍山石斛與栽培霍山石斛特征圖譜,相似度為0.839,主要特征峰基本一致,表明栽培成功可行。金海英等[18]根據石斛苗的生長周期,將霍山石斛分為石斛原球莖、石斛小苗、石斛中苗、石斛大苗和石斛馴化苗5個階段(周期約18個月),在組培過程中,石斛的多糖含量在相對較低的水平上穩步增長(4.7%～14%),且霍山石斛在栽培2年后多糖含量達到最高35.74%(共4年)。而陳程等[19]的研究表明,霍山石斛組培過程中(類原球莖、類原球莖芽、一節苗、多節苗和栽培苗)多糖的單糖組成比例上略有差異,但在多糖含量、多糖組分、化學特性等理化性質和免疫活性方面無顯著差異,具有相似的促進小鼠脾細胞產生IFN-γ和TNF-α的作用,表現出一定的穩定性。陳乃東等[20]對1～4年株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛的多糖和乙醇溶出物動態積累規律進行研究,結果亦表明,以多糖和醇溶出物總量計,組培的霍山石斛以栽培2年采收為宜(合計4～5年),野生霍山石斛及河南石斛以3年株齡的品質最佳。陳乃東等[21]對組培的霍山石斛和野生的霍山石斛的單糖組成分析表明,兩者均含有6種單糖:木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和核糖,但單糖比例差異顯著。同時,錢明雪[15]研究了霍山石斛(栽培苗)多糖的生化特性與季節性變化規律,整體上,多糖含量和粘度呈現出冬季高于夏季的趨勢,1月份多糖含量最高(40.107 g/100 g干重),8月份多糖含量最低(20.093 g/100 g干重);同時,不同季節的多糖均具有調節腸黏膜免疫的活性,從當年11月至次年4月的霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調節活性整體上高于采自5～10月霍山石斛的多糖。總體上來看,當以霍山石斛多糖含量及生化特性為采收標準時,霍山石斛的最佳種植年限為4～5年,最佳的采收時期為當年的11月至翌年的4月。對不同原料及生長發育過程中主要活性成分多糖的變化規律進行研究,有助于后期多糖的分離純化和藥材的合理開發利用。

1.2 霍山石斛多糖的提取

目前,霍山石斛多糖的提取制備多采用水提醇沉、酶法輔助提取、微波和超聲波輔助提取等方法。在傳統水提醇沉工藝中,黃森等[22]利用Box-Behnken法對霍山石斛類原球莖中活性多糖的提取條件進行優化,得到其最佳工藝條件為:提取溫度69.4 ℃,pH5.9,料液比1∶20,提取次數2次,提取時間1.57 h,霍山石斛多糖提取率最高,達到0.1821 g/g。進一步研究表明,DEAE-52樹脂脫色效果較佳,脫色率達到65.47%。張煒玲等[23]采用響應面法優化霍山石斛多糖的提取工藝,最佳提取工藝條件為:料液比為1∶340 (g/mL),提取時間3.25 h,沉淀多糖的乙醇濃度86%,在此條件下霍山石斛多糖的提取率達到38.78%。Xian等[24]利用微波輔助提取霍山石斛多糖工藝,最優工藝條件為提取4次,每次40 min,微波功率550 W,多糖得率達到19.1%,并證實提取次數對多糖得率影響顯著。秦霞等[25]利用超聲波輔助法提取霍山石斛多糖,多糖得率達到28.02%,其最佳提取條件為料液比1∶10 (g/mL)、提取時間30 min、超聲功率250 W。劉艷艷等[26]利用超聲波輔助法提取霍山石斛多糖,在此最優優化條件下多糖平均得率是傳統熱水浸提工藝的1.70倍,同時超聲波輔助提取工藝所得霍山石斛多糖的還原力和ABTS自由基清除率均優于熱水浸提的多糖。魏明等[27]利用超聲波協同纖維素酶法提取霍山石斛多糖,最佳提取工藝條件為料液比1∶40 (g/mL)、纖維素酶500 U/g、酶解溫度40 ℃,酶解時間3 h,超聲波功率為300 W,超聲時間6 min,此時多糖提取量達到0.283 g/g。另外,劉石泉等[28]以疏花石斛為原料對4種提取工藝(傳統水浸提法、纖維素酶法、超聲輔助法和微波輔助法)進行比較,確定纖維素酶法提取多糖得率最高(11.84%),是多糖提取時的首選方案,而傳統水浸提法(9.75%)宜結合超聲輔助法(10.78%)和微波輔助法(9.91%)從而提高多糖得率。需要注意的是,酶法提取多糖雖提高提取率且條件也比較溫和,但采用纖維素酶會降解O-乙酰-β-D-1,4-葡甘露聚糖,在鐵皮石斛、霍山石斛及細莖石斛中均發現有此類多糖[29]。同時采用超聲波和微波輔助提取可顯著的縮短提取時間,但多糖經過超聲或微波處理后其糖鍵可能會發生斷裂等不利影響[29]。霍山石斛多糖的提取方法需要結合多糖的結構特征和生物活性作更進一步的綜合分析,從而根據實驗目的選擇合適的提取方法。

1.3 霍山石斛多糖的分離純化

多糖的純度會影響其生物活性,獲得高純度的多糖是將其應用在醫藥領域不可或缺、至關重要的一步。如需要確證單一多糖化學結構或混合多糖中每一個多糖的單糖組成及其摩爾比,其純度必須在95%以上,因而多糖的分離純化及純度檢測顯的非常重要。

霍山石斛多糖的分離純化過程主要包括分離純化(脫色、除蛋白及低聚糖等雜質)和純度鑒定。黃森[30]對2種脫蛋白方法和4種脫色方法進行比較研究,Sevag法脫蛋白效果(84.73%)優于三氯乙酸(TCA)法(82.99%),且Sevag法多糖總量保持較好。同時比較酒精、H2O2、活性炭和DEAE-纖維素法的脫色效果,其中二乙氨乙基(DEAE)-纖維素法脫色率最高(65.47%),多糖損失率較小(31.73%)。王琳煒等[31]以霍山鐵皮石斛為原料,比較Sevag法、酶法(胰蛋白酶)及酶法-Sevag法對多糖脫蛋白效果及多糖損失率的影響,結果表明,酶法-Sevag法聯用,蛋白脫除率最高(81.58%),且多糖的損失率低(15.63%)。而Sevag法消耗試劑大,多糖損失率較高(32.72%),且酶法蛋白脫除率低(71.88%)。

Zha等[32]最早采用DEAE-纖維素離子交換色譜、Sephacryl S-200、Sephadex G-75和Sephadex G-100等凝膠滲透色譜分離方法,從霍山石斛類原球莖的水溶性多糖中首次分離到一種分子量為22 kDa的均一性多糖HPS-1B23。潘利華等[33]利用DEAE-纖維素離子交換樹脂、Sephacryl S-200從組培霍山石斛莖中分離純化,得到單一多糖組分DHP-W2。Hsieh等[34]利用DEAE-cellulose和Sephacryl S-200從霍山石斛葉和莖的黏液中分離得到一種分子量為9.7×103Da的多糖。蔣玉蘭[35]利用DEAE-52和Sephacryl S-200從霍山石斛中分離得到一個大分子多糖組分DHP-W4,分子量為1.2×106Da。由上可以看出,霍山石斛多糖的分離純化過程中宜采用DEAE-纖維素法脫色和酶法-Sevag法聯用去除蛋白質,而制備霍山石斛均一多糖主要采用離子交換色譜、凝膠滲透色譜等柱層析方法。值得注意的是,柱層析方法耗時多、產量低,不能滿足工業化大生產,需要更加高效的分離純化方法,其中分級醇沉、鹽析及超濾等對霍山石斛多糖的影響有待進一步確證。

2 霍山石斛多糖的理化性質及結構特征

霍山石斛多糖的分子量分布、單糖組成、空間結構及糖苷鍵的連接方式具有明顯特征,多糖的結構與其功效的表達有密不可分的聯系。通過比較發現(表1),霍山石斛多糖主要由葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)及少量的阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)和木糖(Xyl)組成(以葡萄糖為主,葡萄糖:甘露糖>2∶1),推測確定霍山石斛多糖主要是一類O-乙酰葡萄甘露聚糖,廣泛存在(1→4)-α-D-Glcp、(1→6)-α-D-Glcp、(1→6)-β-D-Glcp、(1→4)-β-D-Glcp、(1→3,6)-β-Manp、(1→4)-β-Manp、(1→3,6)-α-D-Manp等糖苷鍵連接方式。但其分子量、單糖組成、連接位置及順序存在較大差異,這可能是由霍山石斛生長環境、提取純化等的不同引起的。Zha等[32]首次從從霍山石斛中成功分離出HPS-1B23,該多糖為α-吡喃構型,平均分子量為2.2×104Da,由葡萄糖、甘露糖、半乳糖按31∶10∶8的摩爾比組成,具有增強免疫力的功效。肖婧婧[37]從霍山石斛類原球莖中分離純化到一大分子均一多糖DHPD2,分子量8.09×106Da,主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖組成,其摩爾比為0.896∶0.723∶0.2∶0.072∶0.031∶0.028。Li等[38]從霍山石斛類原球莖的粗多糖中分離純化得到一種相對分子質量為2.32×105Da單一多糖DHP-4A,單糖組成分析表明,DHPD-4A由葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖構成,摩爾比為13.8∶3.0∶6.1∶2.1。馮寶軍[39]從霍山石斛中分離純化到一分子量為7.3×104Da的多糖組分DHP-W2,主要由葡萄糖、木糖和半乳糖按1.1∶1.0∶0.5的分子摩爾比以及少量的半乳糖醛酸組成。Tian等[40]采用Sephadex G-100凝膠層析對霍山石斛中性多糖(DHP1)進一步分離純化,得到DHP1A和DHP1B兩種多糖片段,相對分子質量分別為6.7、3.51 kDa。DHP1A主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成,其摩爾比為16∶2.5∶1,DHP1B主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成,其摩爾比為10.55∶1.00∶0.21。這些與文獻報道[41]的鐵皮石斛多糖結構特征差異顯著,鐵皮石斛多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等單糖組成(甘露糖占主要),廣泛存在(1→4)-β-D-Glcp、(1→4)-α-D-Glcp、(1→6)-α-D-Glcp、(1→4)-β-D-Manp等糖苷鍵連接方式,同時與香菇多糖(抗腫瘤)、猴頭菌多糖(保肝護胃)和靈芝多糖(抗腫瘤)以β-1,3、β-1,3,6為主的葡聚糖差異顯著[42-44]。綜合上述研究可以看出,不同種源、品種及提取純化方法得到的霍山石斛多糖的理化性質相差較大,目前分離純化到的多糖的分子量主要集中在幾萬,大分子量的均一多糖仍報道較少,需進一步深入研究。

表1 霍山石斛多糖的理化性質和結構特征Table 1 Physicochemical properties and structural features of polysaccharides from Dendrobium huoshanense

3 霍山石斛多糖的生物活性

霍山石斛具有廣泛的藥理作用,是一種無毒、安全的保健食品原料?，F代科學研究表明:霍山石斛多糖具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、保肝護胃和抗白內障等多種生物活性。

3.1 促進細胞健康

3.1.1 抗腫瘤 霍山石斛多糖可通過抑制腫瘤細胞的生長而起到抗腫瘤作用,鮑麗娟等[45]比較了霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛和馬鞭石斛等四種石斛的水提物對人宮頸癌HelaS3和肝癌HepG2細胞的體外抑制作用,結果表明,四種石斛水提物對HelaS3和HepG2細胞均有不同程度的細胞毒性作用,且在所選濃度范圍內對劑量和時間有依賴性。同時,激光掃描共聚焦顯微觀察HelaS3和HepG2細胞,發現細胞正處于凋亡期,從而從形態學驗證了其抑瘤作用。張丹丹等[46]研究發現,經霍山石斛多糖DHP-2處理過的胃癌細胞SGC-7901形態發生固縮,凋亡效果顯著,不僅能明顯下調原癌基因cmyc的表達,表達僅為對照的42.34%。同時,能顯著抑制癌基因野生型p53的表達,其表達比對照高1.04倍。到目前為止,關于霍山石斛的抗腫瘤作用研究還局限于體外活性篩選,因此有必要開展霍山石斛體內抗腫瘤作用試驗,對其活性進行深入的研究,闡明霍山石斛的抗腫瘤作用機制。

3.1.2 增強免疫力 霍山石斛多糖可通過活化淋巴細胞、激活巨噬細胞、自然殺傷/淋巴因子激活的殺傷細胞(NK/LAK細胞)等來調節機體的免疫功能,從而發揮抗腫瘤作用。首先,Zha[32]和Hsieh[34]等證實了霍山石斛水溶性總多糖具有促進小鼠巨噬細胞和脾細胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、白介素10(IL-10)等細胞因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等造血生長因子的功能,并通過分離純化、結構表征和構效關系的研究表明,石斛多糖發揮免疫增強活性需要適度的乙?；＠顒倭⒌萚47]通過研究霍山石斛類原球莖對小鼠免疫調節活性的有效部位及其毒理安全性評價,認為其具有免疫調節活性的有效部位為石斛多糖,且該多糖無毒、無致突變作用。陳程等[19]對不同發育階段的霍山石斛多糖組分(其單糖組成具有差異)的體外免疫活性實驗表明,其不同發育階段霍山石斛多糖的免疫活性卻無顯著性差異,具有相似的促進小鼠脾細胞產生IFN-γ和TNF-α的作用。Li等[38]實驗證實霍山石斛多糖組分DHP-4A具有免疫活性,可以通過激活p38、ERK、JNK和NF-κB的核易位顯著地刺激RAW264.7巨噬細胞分泌NO、TNF-α、白介素-6(IL-6)和IL-10?？梢钥闯?國內外對霍山石斛多糖的研究主要側重于對動物機體細胞、體液免疫、細胞因子誘生等方面,而對免疫系統中各種細胞表面、細胞內和細胞間信息傳遞,受體和它們的控制基因的發生、分化和表達過程許多機制尚未闡明。

3.1.3 抗氧化 目前,普遍認為氧化應激與衰老、神經病變、糖尿病、心血管疾病和癌癥密切相關,從霍山石斛中分離純化的石斛多糖對此類疾病的治療有輔助作用。查學強等[48]比較了霍山石斛和鐵皮石斛多糖的清除自由基的能力,結果表明霍山石斛多糖具有更強的抗氧化活性能力。Tian等[40]實驗證實低分子量霍山石斛多糖組分DHP1A(分子量6.70 kDa)也具有抗氧化活性。而郝杰等[49]對不同分子量霍山石斛多糖的抗氧化效果進行研究,結果表明,不同相對分子量的多糖,在不同抗氧化體系中,其抗氧化活性差異顯著,大分子量的多糖具有更好的抗氧化活性。已有研究表明霍山石斛多糖均具有較顯著的抗氧化效果,其抗氧化效果的大小與石斛的種類、多糖的純度、分子量的大小等因素相關。同時,對于鐵皮石斛,鮑素華等[50]研究認為不同相對分子質量鐵皮石斛多糖均有抗氧化活性,且抗氧化能力與其相對分子質量大小有關,在其研究中,鐵皮石斛多糖分子量小于35.3 kDa或大于74.4 kDa的生物活性更高。綜上分析表明,霍山石斛多糖具有很強的清除DPPH自由基、超氧自由基、H2O2和羥基自由基的能力,并具有顯著的還原力和抑制Fe2+-VC誘導的脂質過氧化,可以從不同角度改善細胞健康。

3.2 降血糖及抗白內障

糖尿病是一種由于缺乏胰島素、胰島素抵抗引起的代謝疾病,其常伴有視網膜病變、白內障、神經病變、腎病、心血管疾病等并發癥。Pan[32]和李秀芳等[51]以四氧嘧啶為誘導劑建立糖尿病小鼠模型,比較霍山石斛(DHP)與4種藥典石斛多糖(鐵皮石斛DOP、金釵石斛DNP、流蘇石斛DFP和鼓槌石斛DCP)的降血糖活性差異,研究發現,DHP、DOP、DNP三種多糖可顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)和糖化血清蛋白(GSP),同時提高血清胰島素(INS)的水平,組織病理學發現DHP、DOP、DNP可修復或減緩胰島的損傷,從而證實DHP、DOP、DNP具有降血糖的效果,且霍山石斛多糖降血糖作用最為顯著。何苗[52]的研究表明,霍山石斛膠囊可顯著減少糖尿病(DM)大鼠的飲水、飲食及排泄量,有效改善DM大鼠“三多一少”的病癥;可降低DM大鼠的血糖水平和血清甘油三脂、膽固醇和游離脂肪酸水平,調節胰島素水平;可修復胰島B細胞,改善細胞形態,增加B細胞數量,從而刺激胰島素分泌,有效調節血糖水平。同時羅建平課題組[53-54],使用糖尿病型大鼠白內障模型,對霍山石斛抗白內障活性化學成分進行研究,表明霍山石斛多糖可以顯著抑制白內障的形成和發展,進一步的藥理實驗表明,霍山石斛多糖可以從下調一氧化氮合酶基因表達和上調谷胱甘肽家族抗氧化酶活性兩方面,協同抑制晶狀體蛋白的糖基化交聯變性,從而抑制晶狀體的渾濁進程并延緩白內障的發生。因而,霍山石斛多糖是一種良好的糖尿病性白內障防治藥物,它能從氧化途徑和蛋白糖基化途徑同時抑制晶狀體渾濁進程。藥用石斛是一類具有明目的傳統中藥材,早在《神農本草經》中就有記載,同時清睛粉中也含有石斛成分,因而霍山石斛多糖抗白內障活性、作用機理和相關產品的開發具有較大的研發空間。

3.3 保護肝臟

目前,酒精性肝損傷已成為僅次于肝炎病毒導致肝損傷的第二大病因,對酒精性肝損傷的防治直接關系到人類的健康安全。孟海濤等[55]以亞急性酒精性肝損傷小鼠為實驗動物模型進行研究,明確多糖是霍山石斛抗小鼠亞急性酒精性肝損傷的功能因子。其中,水提粗多糖各個劑量組均可顯著改善肝臟組織損傷和脂肪變性,降低血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,提高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量,增強肝組織乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,降低肝組織谷胱甘肽(GSH)損耗,抑制肝組織丙二醛(MDA)含量增加。在不同提取物中,霍山石斛水提醇溶物抗亞急性酒精性肝損傷的活性最差,水提物、醇沉物、冷凍干燥物均具有一定的肝損傷保護活性。王鳳華等[56]證實霍山石斛水提取物可降低酒精對肝細胞的損傷作用,其作用機制可能是通過介導NF-κB/p65和p38 MAPK發揮抗氧化、抗炎作用來實現的。錢明雪等[57]分析了6種石斛多糖(霍山石斛、鐵皮石斛、流蘇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛和細莖石斛)對亞急性酒精性肝損傷的干預效果,結果表明,6種石斛多糖的酒精性肝損傷保護活性存在差異,霍山石斛對緩解酒精性肝損傷的效果最好,其中DHP、DOP、DFP能夠抑制小鼠肝組織P4502E1 mRNA的表達,DHP和DOP對小鼠肝組織TNF-α、IL-1 mRNA表達的具有更強的抑制作用。田長城等[58]用四氯化碳(CCl4)構建小鼠急性肝損傷模型,評價霍山石斛不同多糖成分的保肝作用。結果表明,DHP1多糖組分可以有效增強小鼠肝組織對CCl4毒性的抵抗,降低CCl4誘導的血清中谷丙酸轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)活性的升高,抑制肝組織中丙二醛(MDA)的過量表達,同時對超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性呈現恢復作用,表現出良好的預防肝損傷作用。進一步分析表明,DHP1A的攝入可以有效降低CCl4肝損傷中各項生化指標的升高,同時,降低丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的產生。DHP1A進一步調節小鼠肝臟內各種炎性分子的表達,如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-1β、單核細胞趨化蛋白(MCP)-11、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-2和CD68。此外,DHP1A還能夠干擾CCl4誘導的核因子(NF)-kB的激活,從而緩解小鼠的肝損傷[59]?？梢钥闯龌羯绞嗵悄軌蛴行г鰪妼凭愿螕p傷、化學性肝損傷的抵抗能力,是一種潛在的保肝成分,同時其發揮作用的機制與抗氧化損傷和脂質代謝調節有關,而活性多糖的結構基礎及分子作用機理有待更深入研究。

3.4 其他功能活性

霍山石斛多糖除了具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保護肝臟及抗白內障等功能活性外,文獻報道霍山石斛多糖還具有降血脂、抗糖基化和抗疲勞等作用。例如,張靜等[60]研究發現霍山石斛膠囊能夠調節血脂代謝異常,增強抗氧化能力,具有防治脂肪肝和抗動脈粥樣硬化等作用。肖婧婧[37]的研究表明,霍山石斛多糖DHPD1和DHPD2,具有抗蛋白質非酶糖基化的活性,能夠抑制糖基化終產物(AGEs)的形成,它與糖尿病慢性并發癥、動脈粥樣硬化、心血管疾病的發生發展密切相關。夏云建等[61]研究表明,霍山石斛多糖具有抗疲勞的作用,能夠顯著延長小鼠游泳時間,降低運動后小鼠的乳酸累積,降低血清尿素氮和丙二醛水平,增加運動后小鼠的肝糖原儲備值。Wu等[62]研究表明,霍山石斛多糖抑制IL-5、IL-13、IFN-γ和TGF-β1等細胞因子的分泌、改善過敏性皮膚炎患者的體征和癥狀?；羯绞乃幚硌芯吭诮陙砣〉靡欢ǖ倪M展,尤其針對多糖的研究,取得了可喜的成果,但目前研究僅局限于初步的活性篩選和藥效驗證,對作用機制研究涉及不深,更少見臨床的規范研究。

4 霍山石斛多糖消化、代謝研究進展

隨著藥代動力學和腸吸收方法的不斷發展和創新,多糖的吸收研究也取得了突破性進展。消化和酵解作為吸收的關鍵步驟,是使食品變成能被機體吸收的物質,進而在機體發揮其相應功能的過程,因此,對物質消化行為的研究成為了國際研究的熱點。多糖作為大分子糖類,一般認為它難以在胃腸道中被人體消化和吸收,常被用作藥物的保護涂層[63]。多糖的主要代謝途徑是:通過腸道微生物在結腸處發生酵解作用,產生大量的短鏈脂肪酸,如乙酸、丙酸和丁酸[64]。目前,關于石斛多糖的消化吸收研究還很少,李凡[65]和Xie[66]等研究表明,霍山石斛多糖(DHP-2A,分子量1.78×106Da)經口服作用進入胃腸道后發生降解作用,生成一個可以在胃腸道中穩定存在的霍山石斛多糖片段(分子量1.17×104Da)?；羯绞嗵?DHP-2A)在胃腸道中降解的研究表明,霍山石斛多糖(DHP-2A)在體外胃液中發生降解生成一個穩定存在的片段且其保留時間與體內實驗結果一致,但其在體外唾液、腸液中很穩定,說明霍山石斛多糖(DHP-2A)降解的部位是小鼠的胃,最終可以通過吸收作用進入血液。張冠亞[67]對鐵皮石斛多糖體外模擬胃腸道消化的研究表明,唾液不能改變多糖的分子量和還原糖含量,在模擬胃中和模擬腸道中,多糖的分子量降低,從(314.51±6.09) kDa分別減小到(244.79±2.99) kDa和(229.91±1.59) kDa,同時還原糖含量增加,反應后的消化液經過透析并沒有檢測到單糖的產生,表明消化過程中沒有單糖的產生,同時多糖的整體結構并沒有受到破壞,胃和小腸并不能消化多糖。最終發現鐵皮石斛多糖的糖苷鍵連接被人體腸道菌群破壞,促進結腸發育、改善腸道功能和加速腸道蠕動。可以看出,關于不同石斛多糖在胃腸道吸收機制存在一定差異,有待進一步深入研究,為后續多糖在體內發揮功效提供理論基礎。

5 霍山石斛產品開發

5.1 霍山石斛保健食品開發利用現狀

目前,《中國藥典》收錄的胃安膠囊、陰虛胃痛顆粒,是以石斛為主藥,以胃腸道疾病為主治的中成藥,同時收錄的石斛夜光丸,具有滋陰補腎,清肝明目的功效[2]。而脈絡寧注射液、清睛粉等均含有石斛成分。根據國家食品藥品監督管理局批準的國內保健品目錄和進口保健品目錄,目前有5種石斛(霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛、銅皮石斛、細莖石斛)被開發成保健食品,它們分別是霍山石斛(3種劑型,2個品牌)、鐵皮石斛(10種劑型,43個品牌)和金釵石斛(4種劑型,5個品牌),其余均為一個產品。其中,以霍山石斛為主要原料的保健食品的具體情況為:九仙尊霍山石斛股份有限公司開發的霍山石斛清養顆粒(國食健字G20130623)、清養浸膏(國食健字G20140033);安徽永生堂藥業有限責任公司開發的科苑R霍山石斛膠囊(衛食健字(2001)第0012號)。可以看出,霍山石斛為原料開發出的保健品劑型種類和保健功能遠低于鐵皮石斛,不能滿足客戶對不同劑型和功能的需求,因此在霍山石斛類產品的深度開發和綜合利用方面還有待加強。

5.2 產品安全性和功能評價

目前,霍山石斛類產品的安全性評價結果表明,霍山石斛類原球莖多糖無毒,無致突變作用;霍山石斛莖(人工栽培),無急性毒性、亞急性毒性和致突變作用,在試驗劑量范圍內,霍山石斛屬安全性保健食品原料。張煒玲等[68]將200只健康雌性小鼠分為5個試驗組,每組分空白對照、低、中和高(0.5、1.0、3.0 g/(kg·bw))4個劑量組的劑量連續灌胃給藥30 d,完成復方霍山石斛浸膏增強免疫力的研究,不同劑量組均可刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖和轉化作用,可促進小鼠遲發型變態反應,提高小鼠抗體生成細胞數和血清溶血素水平,增強小鼠的單核-腹腔巨噬細胞吞噬功能、碳廓清能力和NK細胞的活性。吳文華等[69]參照《保健食品檢驗與評價技術規范》要求,分別對不同劑量組的小鼠進行細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-噬細胞功能、NK細胞活性測定。結果表明,復方霍山石斛含片具有增強免疫力的作用,其細胞免疫功能和單核-巨噬細胞功能為陽性,體液免疫功能和NK細胞活性為陰性。與此同時陳鋒等[70]研究表明,該復方霍山石斛含片具有清咽功能。根據相關文獻報道[71-73],霍山石斛可以深度開發石斛多糖方面的保健品或藥品,具備抗氧化、輔助降血糖、清咽潤喉和保護肝臟等功效。

6 結論與展望

近些年來,針對霍山石斛多糖活性的研究已成為研究熱點,近50年來霍山石斛在組織快繁、化學成分和藥理活性等研究方面取得了很大的進展,為規?；乱吧耘嗵峁┝己玫募夹g保障,從而在根本上改善因野生霍山石斛資源瀕臨滅絕導致材料缺乏、成本昂貴等研發和加工問題。值得注意的是,目前分離純化的霍山石斛均一多糖,基本上來源于霍山石斛懸浮細胞培養體系及圓球莖,而對于霍山石斛原藥材中多糖的研究,目前尚停留在提取及含量測定階段,很少有關于霍山石斛原藥材的多糖分離、鑒定等報道。目前,Zha[32]研究表明,霍山石斛類原球莖總多糖的組分和生物活性均與野生霍山石斛相當,主要組分和主要活性組分均為HPS-1。而陳乃東等[21]對霍山石斛、銅皮石斛多糖的研究表明,試管苗途徑植株的多糖從單糖種類到含量,與野生植株明顯不同,試管苗時期內生真菌的缺失可能是重要原因。王娣等[74]研究表明,內生菌SH-01對霍山石斛試管苗的生長有顯著的促進作用,但對主要有效成分石斛多糖和生物堿的積累并沒有影響。因此,針對從原藥材中分離純化活性多糖工作有待進一步加強,明確不同原材料對多糖特性的影響。

當前,霍山石斛的綜合利用主要集中在中藥保健品,如霍山石斛楓斗、石斛顆粒、石斛浸膏等,但其開發深度遠滿足不了市場需求,應加強深度開發,以滿足不同人群對霍山石斛產品的養生保健需求。然而,大多數保健食品只停留在霍山石斛整體功能上,其中的天然活性物質的開發利用的深度和廣度還遠遠不夠,基本還多處于提取和一級結構分析上,同時多糖進入體內的變化過程及發揮作用的機制,及更多的毒理學實驗及臨床實驗也需進一步開展。因此,未來的研究應注重四方面工作:一是加強霍山石斛原藥材多糖的分離純化,用均一多糖進行藥理活性和作用機理研究;二是加強霍山石斛多糖的化學結構研究,并在一級結構和高級結構層次上開展藥用石斛多糖的構效關系研究,為后期深入開發霍山石斛類中成藥做準備;三是霍山石斛多糖的體內消化穩定性研究,探索其在胃腸道中的降解和吸收機制;四是進一步完善霍山石斛產品的安全性和毒理學評價。