美洲大蠊脫脂膏中總糖和還原糖含量的測(cè)定

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(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南大理 671000; 2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理 671000)

美洲大蠊(Peripianetaamericana)為昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科昆蟲(chóng),俗稱(chēng)蟑螂,又稱(chēng)蜚蠊[1],其作為藥用的歷史悠久,是一種十分古老的昆蟲(chóng),在蜚蠊科中是體積最大的昆蟲(chóng),在《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早被記載[1],在本草典籍《新修本草》和《本草綱目》也有重要記載[2]。目前以美洲大蠊為原料研發(fā)并用于臨床的藥物有“康復(fù)新液”[3]、“心脈隆注射液”[4]、“肝龍膠囊”[5]。美洲大蠊水解可得到13種氨基酸[6],此外粘多糖、肽、核苷等成分也是主要的活性成分[7-8],具有抗癌、抗肝纖維化、保肝、增強(qiáng)免疫[9]等藥理作用,被廣泛用于創(chuàng)傷的修復(fù)、腫瘤、十二指腸潰瘍等疾病[10]。

美洲大蠊脫脂膏是配制“康復(fù)新液”的原料藥,也是進(jìn)一步分離其它活性部位的原料,其質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系“康復(fù)新液”及其它制劑的質(zhì)量。研究表明,脫脂膏中多糖是其主要活性成分之一[1]。多糖的含量測(cè)定多采用總糖含量減去還原糖含量[11-13]。其中還原糖是糖理化檢測(cè)的重要指標(biāo),而目前美洲大蠊脫脂膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未建立總糖及還原糖的測(cè)定方法,脫脂膏中還原糖的含量測(cè)定尚缺乏報(bào)道。查閱相關(guān)資料,總糖的含量測(cè)定方法如苯酚-硫酸法及蒽酮比色法最為常用[14-15],DNS法常用于還原糖含量測(cè)定或樣品水解后總糖的含量測(cè)定[16-17]。因此,本實(shí)驗(yàn)以美洲大蠊脫脂膏為原料,采用苯酚-硫酸法及蒽酮比色法測(cè)定總糖含量,優(yōu)選出脫脂膏最優(yōu)總糖測(cè)定方法,同時(shí)建立DNS法測(cè)定還原糖含量的方法,以期為美洲大蠊脫脂膏的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美洲大蠊 購(gòu)自云南大理彌渡美蠊養(yǎng)殖基地;葡萄糖 分析純,中國(guó)藥品生物制品檢定所;蒽酮 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;二硝基水楊酸 分析純,北京索萊寶科技有限公司;水 為超純水;其他試劑 均為分析純。

UV2500型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;AL204-IC型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;4500A型多功能粉碎機(jī) 永康市艾澤拉電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備 美洲大蠊脫脂膏:取美洲大蠊干燥成蟲(chóng)粉碎過(guò)二號(hào)篩(24 目)收集粗粉,粗粉用70%乙醇溶液浸泡24 h,浸泡3次,過(guò)濾,將濾液濃縮至干得美洲大蠊浸膏。將制得的浸膏加純化水分散均勻,于70 ℃水浴加熱,油脂析出浮于水面,放冷去除凝固的油脂,將下層溶液繼續(xù)濃縮至棕黑色膏狀物即為脫脂膏[18]。

樣品溶液:稱(chēng)取約1 g的美洲大蠊脫脂膏,加水超聲1 min,超聲頻率50 kHz,溶解,轉(zhuǎn)移、定容至100 mL容量瓶中,搖勻,備用。

1.2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定總糖的含量

1.2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中,分別加5%苯酚溶液1.0、5.0 mL濃硫酸,100 ℃沸水浴加熱20 min,快速冷卻至室溫,定容,搖勻,于400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別移取1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL于25 mL具塞試管中,加適量蒸餾水使總體積為3.0 mL,加入1.0 mL的5%苯酚溶液和濃硫酸5.0 mL,100 ℃沸水浴加熱30 min,迅速冷卻,定容,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3 苯酚用量的考察 移取2.0 mL樣品溶液和2.0 mL蒸餾水于25 mL具塞試管中,分別加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL 5%苯酚溶液,5.0 mL濃硫酸,100 ℃沸水浴中加熱20 min,冷卻至室溫,定容,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.2.4 濃硫酸用量的考察 移取2.0 mL樣品溶液和2.0 mL蒸餾水于25 mL具塞試管中,加入1.0 mL 5%苯酚溶液,分別加入3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL濃硫酸,100 ℃沸水浴加熱20 min,冷卻至室溫,定容,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.2.5 顯色時(shí)間的考察 移取2.0 mL樣品溶液和2.0 mL蒸餾水于25 mL具塞試管中,加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,100 ℃沸水浴加熱10、20、25、30、35、40和45 min,冷卻至室溫,定容,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 移取2.0 mL樣品溶液六份和2.0 mL蒸餾水于25 mL具塞試管中,“1.2.2.2”項(xiàng)操作,測(cè)定吸光度,考察苯酚-硫酸法的精密度。

1.2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱(chēng)取六份約1 g的脫脂膏樣品于100 mL容量瓶中,按樣品溶液制備方法制備美洲大蠊樣品溶液,苯酚-硫酸法測(cè)定樣品溶液的吸光度,考察方法的重復(fù)性。

1.2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 移取樣品溶液2.0 mL按“1.2.2.2”項(xiàng)方法操作,每隔10 min測(cè)定一次吸光度,考察苯酚-硫酸法的穩(wěn)定性。

1.2.2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取美洲大蠊脫脂膏適量于100 mL容量瓶中,平行稱(chēng)取九份,按總糖含量的高、中、低加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,按“1.2.1”項(xiàng)配制美洲大蠊樣品溶液,按“1.2.2.2”項(xiàng)操作測(cè)定吸光度,計(jì)算回收率。

1.2.3 硫酸-蒽酮法測(cè)定總糖的含量

1.2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 移取樣品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管中,在冰水浴中加入0.5 mg/mL硫酸-蒽酮5.0 mL[19],100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷至室溫,在450～700 nm范圍內(nèi)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別移取1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于10 mL具塞試管中,加入蒸餾水使其體積為1.0 mL,在冰水浴中加0.5 mg/mL硫酸-蒽酮溶液4.0 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷卻,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 顯色劑用量的考察 移取樣品溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中,分別在冰水浴中加入0.5 mg/mL硫酸-蒽酮溶液2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0和11.0 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷至室溫,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.3.4 顯色時(shí)間的考察 精密移取樣品溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中,于冰水浴中加入0.5 mg/mL硫酸-蒽酮溶液5.0 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色5、8、10、12和15 min,迅速冷至室溫,測(cè)定吸光度值。

1.2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 移取0.4 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液六份于10 mL具塞試管中,加蒸餾水使其為1.0 mL。按“1.2.3.2”項(xiàng)操作,測(cè)定吸光度,考察硫酸-蒽酮法精密度。

1.2.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱(chēng)取六份約1 g的脫脂膏樣品于100 mL容量瓶中,按樣品溶液制備方法制備美洲大蠊樣品溶液,硫酸-蒽酮法測(cè)定樣品溶液的吸光度,考察方法的重復(fù)性。

1.2.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 移取樣品溶液0.5 mL按“1.2.3.2”項(xiàng)方法操作,每隔10 min測(cè)定一次吸光度,考察硫酸-蒽酮法的穩(wěn)定性。

1.2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取美洲大蠊脫脂膏適量于100 mL容量中,平行稱(chēng)取九份,按含量的高、中、低加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,按“1.2.1”項(xiàng)配制溶液,按“1.2.3.2”項(xiàng)操作測(cè)定吸光度。計(jì)算加樣回收率。

1.2.4 二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量

1.2.4.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 移取樣品溶液1.0 mL于25 mL具塞試管中,加入6.3 mg/mL的DNS試劑3.0 mL[20],100 ℃沸水浴加熱顯色5 min,迅速冷至室溫,加水至25 mL,搖勻,在400～700 nm范圍內(nèi)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別移取1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL具塞試管中,加入蒸餾水使其總體積為2.0 mL,加6.3 mg/mL DNS溶液3 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷卻,定容,搖勻,最佳測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 顯色時(shí)間的考察 移取樣品溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中,加入6.3 mg/mL DNS試劑3.0 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色5、10、15、20、25和30 min,迅速冷至室溫,定容,搖勻,測(cè)定吸光度。

1.2.4.4 顯色劑用量的考察 移取樣品溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中,分別加入6.3 mg/mL DNS溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷至室溫,定容,搖勻,測(cè)定吸光度。

1.2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 移取樣品溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中,加入6.3 mg/mL DNS試劑3.0 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷至室溫,定容,搖勻,每隔10 min測(cè)定一次吸光度,考察方法的穩(wěn)定性。

1.2.4.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密移取2.0 mL樣品溶液于六份25 mL具塞試管中,加入6.3 mg/mL DNS試劑3 mL,100 ℃沸水浴加熱顯色10 min,迅速冷至室溫,定容,搖勻,測(cè)定吸光度。

1.2.4.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱(chēng)取六份1 g的脫脂膏樣品于100 mL容量瓶中,按樣品溶液制備方法制備美洲大蠊樣品溶液,測(cè)定樣品溶液的吸光度,考察方法的重復(fù)性。

1.2.4.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取美洲大蠊浸膏適量于100 mL容量中,平行稱(chēng)取九份,按含量的高、中、低加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,按“1.2.1”配制溶液,按“1.2.4.2”操作測(cè)定吸光度。

1.2.5 樣品中總糖及還原糖含量的測(cè)定 稱(chēng)取不同批號(hào)的脫脂膏1 g按“1.2.1”項(xiàng)配制溶液,苯酚-硫酸法及硫酸-蒽酮法測(cè)定不同批次美洲大蠊樣品的吸光度,計(jì)算樣品中總糖含量。DNS法測(cè)定樣品溶液吸光度,并計(jì)算還原糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量的測(cè)定

2.1.1 苯酚-硫酸法

2.1.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 苯酚-硫酸法測(cè)定美洲大蠊脫脂膏中總糖含量時(shí),最大吸收波長(zhǎng)如圖1所示。

圖1 光譜吸收曲線Fig.1 The curve of spectral absorption

苯酚硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在491 nm處有最大吸收峰,而樣品溶液在489 nm有最大吸收,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),二者最大吸收波長(zhǎng)并不能達(dá)到完全一致,原因可能是美洲大蠊脫脂膏配成的樣品為淡黃色溶液,原料除糖類(lèi)物質(zhì)外還含有其他成分的混合物,因此可能會(huì)對(duì)吸收波長(zhǎng)造成偏差,因此本實(shí)驗(yàn)綜合考慮,最終以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)491 nm為最終測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。線性回歸方程為y=9.0383x+0.0807。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.004～0.100 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,R2=0.9996。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of glucose

2.1.1.3 濃硫酸用量對(duì)吸光度的影響 由圖3可知,硫酸用量在3.0～5.0 mL時(shí),吸光度呈上升趨勢(shì),當(dāng)用量達(dá)到5.0 mL時(shí),吸光度達(dá)到最大值;當(dāng)用量繼續(xù)增大時(shí),吸光度值反而呈下降趨勢(shì),可能由于當(dāng)濃硫酸用增大時(shí),使溶液中單糖部分碳化,而使吸光度呈下降趨勢(shì)。為了節(jié)省試劑,本實(shí)驗(yàn)最終選擇濃硫酸的用量為5.0 mL。

圖3 不同濃硫酸用量對(duì)吸光度的影響Fig.3 The effect of different concentrations of sulfuric acid on absorption

2.1.1.4 苯酚用量對(duì)吸光度的影響 苯酚主要與單糖脫水形成的衍生物結(jié)合成有色化合物。由圖4可知,苯酚用量在0.5～1.0 mL范圍內(nèi)時(shí),吸光度呈上升趨勢(shì);在1.0～2.0 mL范圍內(nèi)時(shí),吸光度值反而有所下降,故選擇反應(yīng)完全時(shí)苯酚用量1.0 mL為最佳用量。

圖4 不同苯酚用量對(duì)吸光度的影響Fig.4 The effect of different concentrations of phenol on absorption

2.1.1.5 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響 由圖5可知,當(dāng)顯色時(shí)間為30 min時(shí),吸光度達(dá)到最大值,反應(yīng)較完全;而30 min之后吸光度隨著加熱時(shí)間增加而下降,可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),苯酚與單糖形成的有色中間產(chǎn)物不穩(wěn)定而影響吸光度測(cè)定。為了使反應(yīng)完全又不影響有色化合物的穩(wěn)定性,選擇30 min為最佳顯色時(shí)間。

圖5 不同顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.5 The effect of different developing time on absorption

2.1.1.6 精密度實(shí)驗(yàn) 苯酚-硫酸法平行六次測(cè)定樣品溶液的吸光度,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)定的吸光度值為0.533±0.006(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%。該方法測(cè)定美洲大蠊脫脂膏總糖精密度良好,能滿足樣品分析要求。

2.1.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量為85.03±2.32 mg/g(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%,表明苯酚-硫酸法測(cè)定樣品總糖含量的重復(fù)性較好。

2.1.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 苯酚-硫酸法測(cè)定的吸光度值為0.725±0.021(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%。苯酚-硫酸法測(cè)定樣品時(shí)在50 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 加樣回收率結(jié)果如表1所示。苯酚-硫酸法測(cè)定總糖的加樣回收率為98.72±1.96(n=9),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%。苯酚-硫酸法測(cè)定樣品總糖的加樣回收率良好,說(shuō)明該分析方法準(zhǔn)確可靠。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)Table 1 Results of recovery rate test

2.1.2 硫酸-蒽酮法

2.1.2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 硫酸-蒽酮法測(cè)定美洲大蠊脫脂膏中總糖含量時(shí),最大吸收波長(zhǎng)如圖6所示。

圖6 光譜吸收曲線Fig.6 The curve of spectral absorption

硫酸蒽酮法測(cè)定時(shí)不同的含糖物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致測(cè)定條件有偏差,存在一定的波動(dòng)性[21]。因此,本實(shí)驗(yàn)吸收波長(zhǎng)的選擇主要以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為參考依據(jù),選擇621 nm為最終測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 硫酸蒽酮法測(cè)定總糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。線性回歸方程為y=5.9444x+0.0994。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.02～0.20 mg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,R2=0.9996。

圖7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of glucose

2.1.2.3 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響 由圖8可知,當(dāng)顯色劑用量在4.0 mL時(shí),吸光度值達(dá)到最大;當(dāng)顯色劑用量在7.0 mL時(shí),吸光度值下降明顯,可能是由于隨著硫酸用量的增加,其強(qiáng)氧化性影響了蒽酮與衍生物反應(yīng)生成的藍(lán)綠色糠醛衍生物的穩(wěn)定性,導(dǎo)致吸光度值降低。因此選擇4.0 mL為最佳顯色劑用量。

圖8 不同顯色劑用量對(duì)吸光度的影響Fig.8 The effect of different dosage of chromogenic agent on absorption

2.1.2.4 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響 由圖9可知,吸光度值隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,當(dāng)顯色時(shí)間為10 min時(shí),吸光度值達(dá)到最大值,此時(shí)反應(yīng)完全;之后吸光度值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)有色復(fù)合物的穩(wěn)定性有一定影響。故顯色時(shí)間選擇為10 min。

圖9 不同顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.9 The effect of different heating time on absorption

2.1.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 硫酸-蒽酮法平行六次測(cè)定樣品溶液的吸光度,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)定的吸光度值0.592±0.009(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%。硫酸-蒽酮法測(cè)定美洲大蠊脫脂膏總糖精密度良好,能滿足樣品分析要求。

2.1.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 硫酸-蒽酮法測(cè)定總糖含量為(86.08±1.77) mg/g(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%。表明硫酸-蒽酮法測(cè)定樣品總糖含量的重復(fù)性較好。

2.1.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 硫酸-蒽酮法測(cè)定的吸光度值為0.722±0.006(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%。硫酸-蒽酮法測(cè)定樣品時(shí)在50 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 加樣回收率結(jié)果如表2所示。硫酸-蒽酮法測(cè)定總糖的加樣回收率為97.74±2.52(n=9),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%,表明硫酸-蒽酮法測(cè)定樣品總糖的加樣回收率良好。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 2 Results of recovery rate test

2.1.3 樣品中總糖的含量 樣品中總糖的含量測(cè)定結(jié)果如表3～表4所示。苯酚-硫酸法和硫酸-蒽酮法分別測(cè)定五個(gè)不同批次的美洲大蠊脫脂膏中總糖含量,不同批次制得的美洲大蠊脫脂膏中總糖的含量相差明顯,如苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量最大為81.2 mg/g,最小為58.5 mg/g。

表3 苯酚-硫酸法測(cè)定的樣品總糖含量Table 3 Total sugar content results of samples

表4 蒽酮比色法測(cè)定的樣品總糖含量Table 4 Total sugar content results of samples

2.1.4 苯酚-硫酸法與硫酸-蒽酮法總糖測(cè)定結(jié)果的比較 苯酚-硫酸法和硫酸-蒽酮法分別測(cè)定美洲大蠊脫脂膏中總糖的含量,并比較兩種方法測(cè)定的優(yōu)劣,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 美洲大蠊脫脂膏中總糖的兩種測(cè)定方法的比較Table 5 Comparison of two methods for determination of total sugar in degreasing cream from Periplaneta americana

由表5可知,兩種方法均可用于脫脂膏總糖含量的測(cè)定,但通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),硫酸-蒽酮法中硫酸-蒽酮溶液的加入需要在冰水浴中完成,操作繁瑣。且加熱顯色后,不能用蒸餾水定容,否則待測(cè)液渾濁,測(cè)定誤差大。因此本實(shí)驗(yàn)綜合考慮,選用苯酚-硫酸法用于美洲大蠊脫脂膏總糖含量的測(cè)定。

2.2 還原糖含量的測(cè)定

2.2.1 二硝基水楊酸法

2.2.1.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 結(jié)果如圖10所示。DNS法測(cè)定美洲大蠊脫脂膏中還原糖含量時(shí),葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在494 nm有最大吸收,而樣品溶液則在489 nm有最大吸收,兩者最大吸收波長(zhǎng)并不相同,可能是由于美洲大蠊脫脂膏水溶液為有色溶液,測(cè)定時(shí)可能存在自身因素的影響。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,樣品本身自帶的顏色會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)吸收波長(zhǎng)有一定影響[20]。因此,本實(shí)驗(yàn)綜合考慮選擇葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收波長(zhǎng)494 nm為最終測(cè)定波長(zhǎng)。

圖10 光譜吸收曲線Fig.10 The curve of spectral absorption

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 DNS法測(cè)定還原糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖11所示。線性回歸方程為y=36.765x-0.1333。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.004～0.040 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,R2=0.9996。

圖11 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.11 The standard curve of glucose

2.2.1.3 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響 圖12結(jié)果顯示,當(dāng)加熱時(shí)間10 min反應(yīng)完全,吸光度有最大值。當(dāng)顯色時(shí)間到15 min時(shí)吸光度值反而有所下降,可能由于顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響有色復(fù)合物的穩(wěn)定性。因此最終選擇10 min為最終顯色時(shí)間。

圖12 不同顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.12 The effect of different heating time on absorption

2.2.1.4 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響 由圖13可知,當(dāng)顯色劑用量為3 mL時(shí),吸光度呈最大值反應(yīng)完全。從經(jīng)濟(jì)角度考慮選擇3.0 mL為最佳用量。

圖13 不同顯色劑用量對(duì)吸光度的影響Fig.13 The effect of different dosage of chromogenic agent on absorption

2.2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) DNS法測(cè)定樣品還原糖吸光度為0.787±0.009(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%。表明DNS測(cè)定美洲大蠊脫脂膏還原糖精密度良好,能夠滿足樣品分析要求。

2.2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) DNS法測(cè)定脫脂膏還原糖含量分別為(35.07±0.22) mg/g(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%。表明DNS法測(cè)定樣品還原糖含量的重復(fù)性良好。

2.2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) DNS法測(cè)定樣品還原糖吸光度為0.717±0.006(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%。表明DNS法測(cè)定還原糖含量在50 min內(nèi)顯色穩(wěn)定,該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 加樣回收率結(jié)果如表6所示。DNS法測(cè)定樣品還原糖含量加樣回收率為96.84±1.17(n=9),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%。表明DNS法準(zhǔn)確可靠,可用于美洲大蠊脫脂膏還原糖含量測(cè)定。

表6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 6 Results of recovery rate test

2.2.2 樣品中還原糖的含量 樣品還原糖含量測(cè)定結(jié)果如表7所示。DNS法對(duì)不同批次的樣品的還原糖含量測(cè)定,不同批次制得的脫脂膏還原糖含量相差較大?？赡苡捎诿乐薮篌乖陴B(yǎng)殖過(guò)程中飼料,環(huán)境等因素不同導(dǎo)致原料中所含還原糖含量有較大差異。

表7 樣品還原糖含量的測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of reducing sugar

3 結(jié)論

采用苯酚-硫酸法及硫酸-蒽酮法對(duì)美洲大蠊脫脂膏中總糖含量進(jìn)行測(cè)定,優(yōu)選出苯酚-硫酸法做為美洲大蠊脫脂膏總糖測(cè)定方法。最佳總糖測(cè)定條件為苯酚用量1.0 mL、硫酸用量5.0 mL、顯色時(shí)間為30 min。最佳還原糖測(cè)定條件為顯色劑用量3.0 mL、顯色時(shí)間10 min。苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.004～0.100 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率為98.7%,RSD為2.0%,R2=0.9996。二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.004～0.040 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率為96.8%,RSD為1.6%,R2=0.9996。兩種測(cè)定方法具有重現(xiàn)性好、試劑用量少、精密度高、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境及設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn),可分別作為美洲大蠊脫脂膏總糖及還原糖含量測(cè)定方法。

通過(guò)對(duì)5批美洲大蠊脫脂膏樣品中總糖及還原糖的含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),不同批次間的總糖及還原糖含量均相差明顯,可能與美洲大蠊養(yǎng)殖過(guò)程中飼料配比、養(yǎng)殖溫度等因素有關(guān)。而糖是美洲大蠊脫脂膏中主要活性成分之一,直接關(guān)系到“康復(fù)新液”及其它制劑的質(zhì)量,因此建立總糖及還原糖含量的測(cè)定方法,可對(duì)美洲大蠊脫脂膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。