不同水煮時間對黑胡椒粉水煮液中風味物質的影響研究

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(1.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所,海南萬寧 571533; 2.國家重要熱帶作物工程技術研究中心,海南萬寧 571533; 3.農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室,海南萬寧 571533; 4.海南省熱帶香料飲料作物工程技術研究中心,海南萬寧 571533)

胡椒(PipernigrumL.)為胡椒科胡椒屬多年生常綠藤本植物,是世界上重要的調味香料。在所有香料中胡椒的種植規模、產量和價值等都居于首位,被稱為“香料之王”和“烏(黑)金”[1]。世界上胡椒主要分布在南美洲的中部和北部,主產國是印度、印度尼西亞、越南等,我國胡椒種植面積和產量分別居世界第6位和第5位。海南省是我國胡椒主產區,種植面積和產量均占全國的90%以上,種植面積約33萬畝,產量約3.8萬噸,年均產值20多億元[2]。

胡椒常用于肉類食品的烹調[3],具有改善風味、增進食欲等功效,這與其風味活性成分密切相關。國內外關于胡椒風味成分的研究報道相對較多,胡椒堿是胡椒中的重要活性成分,不僅賦予胡椒強烈的辛辣味,而且具有抗炎鎮痛、抗抑郁、抗腫瘤、促進藥物代謝等作用[4-6]。胡椒精油亦被稱為揮發油,是胡椒香氣的主要物質來源[7],可采用水蒸汽蒸餾[10]、固相微萃取[9]、超臨界流體等技術萃取[10-11],主要由89%萜烴、含氧萜烯及芳香化合物組成[9],具有抗氧化活性[12]。根據胡椒精油萃取方法和檢測儀器的不同,檢測到的風味化合物亦有所不同,Cardeal等[13]采用全二維氣相色譜-質譜聯用儀檢測到胡椒中存在273種揮發性化合物。這些化合物的組成及含量會受到所用胡椒產區、品種以及原料成熟度、前處理方式以及制備工藝等的影響而不同[14-17]。胡椒風味物質在日常煮制過程中容易揮發,但其對于煮制液中胡椒風味的影響及變化規律尚未見研究報道。

本實驗以黑胡椒為主要原料,采用HS-SPME-GC-MS和HPLC技術,研究黑胡椒粉風味物質在水煮過程中的變化,以期為調控胡椒風味、胡椒揮發油的提取以及胡椒調味產品的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑胡椒粒 由海南興科熱帶作物工程技術有限公司提供;95%乙醇(分析純) 西隴化工股份有限公司;甲醇(色譜純) 默克股份兩合公司(德國);胡椒堿(色譜純,純度>98.00%) 北京世紀奧科生物技術有限公司。

Agilent 7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 上海安譜實驗科技股份有限公司;SPME 手動進樣手柄 美國安捷倫科技有限公司;HW·SY11 型電熱恒溫水浴鍋 常州恒隆儀器有限公司;QE-300 g高速萬能粉碎機 浙江屹立工貿有限公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;HDM-100電熱套 常州國華電器有限公司;AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 用粉碎機粉碎黑胡椒粒,粉末過篩,收集60～80目篩中間的粉末,準確稱取10.00 g黑胡椒粉于1000 mL圓底燒瓶中,加入500 mL去離子水,燒瓶口接揮發油接收器和冷凝管,電熱套加熱,水溶液沸騰后開始計時(10、30、60、90、120、180、240 min),收集揮發油后,將圓底燒瓶取出冷卻至室溫后,將水煮液于4000 r/min下離心5 min,收集上清液,待測水煮液中的風味物質。

1.2.2 胡椒堿含量測定 用高效液相色譜儀檢測上清液中的胡椒堿含量,儀器檢測條件參考國家標準(GB 17582-2009),即以甲醇和水為流動相,體積比為77∶23,流速為1.0 mL/min,檢測波長為343 nm,進樣量10 μL,外標法定量。即準確稱取胡椒堿標準品0.0013 g,加入95%乙醇溶解后定容至10 mL棕色容量瓶中,取1.0 mL該溶液配制25 mL工作液,并用工作液配制不同濃度的標準溶液,過0.45 μm膜,高效液相色譜儀檢測。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制胡椒堿標準曲線,通過線性擬合得到回歸方程:y=115.51x-47.69,相關系數為0.9973。

1.2.3 胡椒揮發油含量測定 參考國家標準GB/T 17527-2009《胡椒精油含量測定》的方法測定,以實驗設計1.2.1收集的黑胡椒粉為主要原料,利用水蒸汽蒸餾出揮發油,根據所得揮發油體積,計算單位質量胡椒樣品所含揮發油含量,重復3次測定。

1.2.4 胡椒水煮液中揮發性風味物質的HS-SPME-GC-MS分析 參考Henryk等[9]的方法略有修改,以DVB/CAR/PDMS纖維頭為萃取頭,在250 ℃老化后,準確稱取3.00 g實驗設計1.2.1收集的上清液于15 mL固相微萃取瓶中,50 ℃水浴平衡15 min后插入老化好的萃取頭頂空萃取15 min,然后在進樣口250 ℃解吸8 min,進行GC-MS分析測定。

GC-MS分析條件:色譜柱型號:BR-5 MS(30 m×0. 25 mm,0.25 μm)。升溫程序:起始溫度為40 ℃,保持5 min,然后以3 ℃/min升到45 ℃,保持3 min,然后以4 ℃/min升到100 ℃保持2 min,以5 ℃/min升到230 ℃,保持5 min;載氣(He)流速1. 0 mL/min,進樣量1 μL,不分流。離子源為EI源,溫度為230 ℃,接口溫度150 ℃,全掃描:m/z 35～550。

通過NIST14譜庫檢索數據,采用峰面積歸一化法計算各化合物的相對百分比含量。

1.3 數據分析

所得數據用Excel和SPSS 17.0分析,色譜圖用Origin 8.5繪制。

2 結果與分析

2.1 水煮時間對水溶液中胡椒堿含量的影響

胡椒堿標準品和水煮液的HPLC圖譜見圖1。

圖1 胡椒堿標準品(A)和胡椒水煮液(B)的高效液相圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of piperine standard(A) and the solution of boiled black pepper(B)

由圖1可知,在同一檢測條件下,與胡椒堿標準品的高效液相圖譜比對,發現胡椒堿標準品的保留時間和胡椒煮制液中的保留時間一致,確定胡椒煮制液中含有胡椒堿,這說明胡椒煮制過程中,胡椒粉中的胡椒堿逐漸被溶解在水煮液中。

從圖2可以看出,隨著煮制時間的延長,水煮液中胡椒堿含量呈現逐漸增加的趨勢,煮制90 min時,水煮液中的胡椒堿含量最高,然后逐漸趨于平緩,煮制時間過久,胡椒堿含量會緩慢降低,這與Nisha等[4]研究報道的一致,胡椒堿在加熱的情況下含量會隨著時間的延長而減少,這可能與胡椒堿的熱不穩定性有關。以上說明,適宜的水煮時間可加速胡椒粉中的胡椒堿的溶出,選擇水煮時間90 min為宜。

圖2 不同時間下水煮液中胡椒堿的含量Fig.2 Contents of piperine in the solution of boiled black pepper at different time

2.2 水煮時間對胡椒揮發油含量的影響

在煮制過程中,通過燒瓶上接揮發油收集器和冷凝管收集揮發油,發現胡椒粉在水溶液中沸騰后,揮發油在開始階段迅速被蒸發出來,隨著時間延長,含量緩慢增加,見圖3。水煮30 min時,其揮發油含量達到1.105 mL/100 g,與10 min時無顯著性差異(p>0.05),水煮60、90 min,其揮發油含量分別增加到1.328、1.366 mL/100 g,而水煮120 min,其揮發油含量達到1.66 mL/100 g,與水煮180、240 min無顯著性差異(p>0.05),其揮發油含量均為1.66 mL/100 g。根據國家標準《GB/T 17527-2009 胡椒精油含量的測定》,胡椒粉揮發油測定需要蒸餾提取4 h,以提取4 h所得的胡椒精油含量為胡椒粉中精油的總含量,通過計算發現,胡椒粉水煮10 min,其66.60%的揮發油即可被蒸餾出來,水煮60 min,胡椒粉中80%的揮發油可被蒸餾出來,水煮120 min,揮發油含量趨于最大,之后基本保持不變。由此推斷,胡椒粉中的揮發油容易被蒸餾出來,在水煮過程中水煮時間不宜超過120 min。但水煮時間是否影響水煮液中風味物質的組成不得而知,因此,特對胡椒水煮液進行HS-SPME-GC-MS分析。

圖3 不同水煮時間對揮發油含量的影響Fig.3 Effect of different boiling time on the content of volatile oil 注:不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著(p<0.05);圖5同。

2.3 水煮時間對水煮液中風味物質組成的影響

不同水煮時間下水煮液中風味物質的總離子流圖見圖4。從圖4可以看出,不同水煮時間下胡椒水煮液中的風味化合物數量存在顯著性差異(p<0.05)。

圖4 不同水煮時間下胡椒水煮液中風味物質的總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatograms of flavor components in the solution of boiled black pepper at different time

不同水煮時間下水煮液中風味物質的總峰面積如圖5所示。從圖5可以看出,隨著煮制時間的延長,水煮液中風味物質的總峰面積在不斷減少,煮制10 min風味物質總峰面積最高,其次是煮制30 min,煮制240 min風味物質總峰面積最低。這與胡椒中揮發性風味物質的揮發性有關,浸沒于水中的胡椒粉隨著水煮時間的延長,其中的揮發性風味物質逐漸與水蒸汽共餾出來,因此檢測到的水煮液中揮發性風味物質總量在減少,這與本實驗結果與分析2.2中胡椒粉揮發油含量結果一致,隨著水煮時間的延長,通過揮發油收集器收集到的揮發油含量在逐漸增加。Nisha等[4]研究了不同烹飪過程中黑胡椒粉中胡椒堿和胡椒油樹脂的降解動力學,發現黑胡椒粉中胡椒堿和胡椒油樹脂的含量隨著烹飪溫度的增加和烹飪時間的延長而逐漸減少,在相同烹飪時間下,溫度越高,胡椒堿和胡椒油樹脂含量減少的程度越大。以上表明,黑胡椒粉中的揮發性風味物質在水煮條件下容易揮發,胡椒煮制時間不宜過長。

圖5 不同水煮時間下風味物質的總峰面積Fig.5 Total peak area of flavor components in the solution of boiled black pepper at different cooking time

在不同水煮時間下胡椒水煮液中風味物質的相對百分比含量見表1。

表1 不同水煮時間下胡椒水煮液中風味物質的相對含量Table 1 Relative content of flavor components in the solution of boiled black pepper at different boiling time

續表

從表1中可以看出,黑胡椒粉在不同水煮時間下,隨著水煮時間的增加,水煮液中可檢測出的風味物質數量在逐漸減少,分別為65、63、44、50、32、30、32種化合物。從化合物種類來看,胡椒水煮液中的揮發性風味物質主要為單萜類化合物、倍半萜類和少量的芳香化合物。在水煮過程中,各種類化合物相對含量均存在較大變化。其中,相對含量較高的風味物質是石竹烯(55.75%,60 min)、3-蒈烯(19.95%,10 min)、檸檬烯(15.00%,10 min)、δ-欖香烯(13.35%,60 min)、胡椒烯(9.38%,180 min)。Jirovetz等[7]、Martins等[8]、Henryk等[9]等指出胡椒特征風味主要來源于胡椒精油中的石竹烯、檸檬烯、β-蒎烯、3-蒈烯、β-水芹烯、α-律草烯、胡椒烯、欖香烯等化合物,Jagella等[18]采用濃度稀釋法鑒定出馬來西亞黑胡椒中的特征風味物質是芳樟醇、α-水芹烯、檸檬烯、月桂烯、α-蒎烯、3-甲基丁醛和甲基丙醛。由于本實驗僅對胡椒水煮液進行分析,α-水芹烯、3-甲基丁醛和甲基丙醛等化合物未檢出,芳樟醇相對含量較低,最高不超過0.81%,考慮到胡椒品種和生產區域差異,特選擇水煮液中相對含量較高的特征風味成分β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、檸檬烯、δ-欖香烯、胡椒烯、石竹烯和律草烯8種風味化合物作圖6,以明確比較海南省黑胡椒風味物質在不同水煮時間下的變化規律。

圖6 不同水煮時間下胡椒水煮液中主要風味物質的相對含量Fig.6 Relative content of main flavor components in the solution of boiled black pepper at different boiling time注:1:β-蒎烯;2:月桂烯;3:3-蒈烯;4:檸檬烯;5:δ-欖香烯;6:胡椒烯;7:石竹烯;8:律草烯。

圖6中β-蒎烯、月桂烯、3-蒈烯、檸檬烯等化合物屬于單萜烯類化合物,δ-欖香烯、胡椒烯、石竹烯和律草烯等化合物為倍半萜烯類化合物。從圖6可以看出,單萜烯類化合物隨著水煮時間的延長呈現緩慢減少后緩慢增加的趨勢,在60 min時相對含量最低,而倍半萜烯類化合物隨著水煮時間的延長呈現先增加后緩慢減少,在水煮60 min時相對含量達到最高。石竹烯是胡椒水煮液中相對含量最高的倍半萜類化合物,水煮10 min即可迅速增加至26.22%,水煮60 min時相對含量最高,達到55.75%,然后緩慢降低至46.63%。3-蒈烯是胡椒水煮液中含量次高的單萜烯類化合物,在水煮過程中,隨著水煮時間的增加,其相對含量由水煮10 min的19.95%降低至30 min的15.11%,在水煮60 min時最低,之后又緩慢增加至8.08%。這些風味化合物在水煮過程中呈現的規律性變化,與各化合物的性質有關,由于倍半萜烯類化合物沸點相對單萜類化合物較高,在同一水煮條件下,揮發程度不一樣,且在水煮時外接冷凝裝置和揮發油收集器,在水煮過程中逐漸被蒸餾出來,這些風味物質多是揮發性的香味物質,雖然大多數不溶于水,但胡椒中存在淀粉、蛋白質等多種成分,在水煮過程中,風味物質可能與其他成分存在吸附或相互作用而發生含量變化,致使水煮液呈現不同的風味。如β-蒎烯具有特有的松節油香氣,月桂烯亦稱為香葉烯,具有令人愉快的香氣,3-蒈烯具有松木樣香氣,檸檬烯具有柑橘、檸檬的香氣,δ-欖香烯具有溫和的木香氣味,胡椒烯亦稱為古巴烯,具有蒿草味;石竹烯和律草烯具有辛香、柑橘香、溫和的丁香香氣[18]。結合水煮液中胡椒堿含量變化規律,綜合分析比較,黑胡椒粉水煮60 min內,水煮液呈現松木香味,水煮60 min后,胡椒水煮液呈現辛香味。

3 結論

本文采用HPLC和HS-SPME-GC-MS研究了黑胡椒粉在不同水煮時間下水煮液中風味物質的組成及含量變化,結果表明,胡椒中的主要辣味物質胡椒堿在水煮90 min時含量最高;水煮60 min黑胡椒粉中80%的揮發油可被蒸餾出來,水煮120 min揮發油含量趨于最大值;對黑胡椒水煮液進行HS-SPME-GC-MS分析,共鑒定出66種揮發性風味物質,單萜烯類化合物隨著水煮時間的延長呈現緩慢減少后緩慢增加的趨勢,在60 min時相對含量最低,而倍半萜烯類化合物隨著水煮時間的延長呈現先增加后緩慢減少,在水煮60 min時相對含量達到最高,其中,石竹烯在水煮60 min時含量最高55.75%,而3-蒈烯(19.95%)、檸檬烯(15.00%)和β-蒎烯(4.72%)在水煮10 min時含量最高,δ-欖香烯(13.35%)在水煮60 min時含量最高;隨著水煮時間的增加,胡椒水煮液中風味物質的數量逐漸減少,表明黑胡椒粉水煮時間不宜過長。這些風味化合物隨著水煮時間的變化而發生組成及含量變化,賦予了胡椒水煮液不同的風味,黑胡椒粉水煮60 min內,水煮液整體呈現松木香味,水煮60 min后,胡椒水煮液整體呈現辛香味。