響應面法優化馬鞭草中總黃酮閃式提取工藝及其體外抗氧化活性

(南陽醫學高等?？茖W校,河南南陽 473061)

馬鞭草(VerbenaofficinalisL.)為馬鞭草科植物馬鞭草的干燥地上部分,馬鞭草作為傳統中藥,收錄于《中國藥典》之中,具有活血散瘀、解毒、利水消腫、退黃、截瘧等功效[1-2],在臨床上廣泛用于治療白喉、瘧疾等癥狀?！吨袊幍洹?015版將馬鞭草中齊墩果酸和熊果酸作為馬鞭草質量控制的主要指標,但是馬鞭草中還存在多種化學成分如:黃酮類、揮發油類、環烯醚萜類、糖類等[3-4]。這些化學成分也具有顯著的活性作用,故亟需對其理化性質及生物活性進行研究分析。其中黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類天然產物,具有抗炎、抗病毒、強心、鎮靜、鎮痛、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等作用[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鞭草 購于河南省藥材公司,并經鑒定為VerbenaOfficinalisL.全草;蘆丁 上海晶純實業有限公司,純度>99%;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH· Sigma);鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、抗壞血酸、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁 均為國產分析純,使用前未進一步純化,水為蒸餾水。

JHBE-50S閃式提取器 河南金鼎科技有限公司;Lab Tech UV-BlueStra紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司;BS210S電子分析天平 北京賽多利斯公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;RE52CS旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;TDL-5-A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 以蘆丁為對照品,精密稱取105 ℃下干燥至恒重的蘆丁0.0200 g,用少量70%的乙醇溶解,定容于100 mL容量瓶中,搖勻,其質量濃度為0.2000 g·L-1。分別移取蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、0.4、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL比色管中,加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,充分搖勻,靜置6 min。再加入4%的NaOH溶液4 mL,混勻后用70%的乙醇定容至刻度,搖勻并放置15 min,以試劑空白為對照,用1×1 cm的比色皿在507 nm處測定吸光度[19]。以蘆丁濃度C為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為:y=11.53x-0.0059,R2=0.9989。表明蘆丁對照品溶液在10.00～60.00 μg/mL范圍內濃度和吸光度線性關系良好。

1.2.2 馬鞭草中總黃酮的提取及含量的測定 閃式提取馬鞭草中總黃酮的工藝流程:將自然風干至恒重的馬鞭草粉碎后過60目篩,準確稱取2.00 g置于250 mL閃式提取器中進行閃式提取,提取液經離心后抽濾,將濾液經減壓濃縮至無醇味后用70%的乙醇溶液，定容至250 mL容量瓶中。

總黃酮含量的測定:采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH[19]分光光度法。準確量取樣品溶液2 mL于10 mL比色管中,按照“1.2.1”中所述方法進行操作,以試劑空白為對照,用1×1 cm的比色皿在507 nm處測定吸光度,計算馬鞭草中總黃酮的含量。

總黃酮含量(mg/g)=提取的總黃酮質量(mg)/原料質量(g)

1.2.3 閃式提取馬鞭草中總黃酮的單因素實驗 以乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數四個因素為研究對象,以馬鞭草中總黃酮含量為指標進行單因素實驗。

1.2.3.1 乙醇濃度的選擇 準確稱取6份已粉碎的馬鞭草樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,在固定料液比1∶30 g/mL、閃式提取時間為2 min、提取1次的條件下進行閃式提取。考察不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對總黃酮含量的影響。

1.2.3.2 料液比的選擇 準確稱取6份粉碎的馬鞭草樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,在固定乙醇濃度60%、提取時間為2 min、提取1次的條件下,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50 g/mL)對總黃酮含量的影響。

1.2.3.3 提取時間的選擇 準確稱取6份粉碎的馬鞭草樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,固定料液比為1∶35 g/mL、乙醇濃度為60%、提取1次的條件下,考察提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min)對總黃酮含量的影響。

1.2.3.4 提取次數的選擇 準確稱取5份粉碎的棗果皮樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,固定料液比為1∶35 g/mL、乙醇濃度為70%、提取時間為2 min,考察提取次數(1、2、3、4、5次)對總黃酮含量的影響。

1.2.4 響應面優化試驗 采用Box-Behnken的中心組合原理為依據,以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為自變量,總黃酮的含量為因變量,采用4因素3水平響應面優化提取工藝,利用統計學分析軟件Design Expert 8.0.6軟件建立數字回歸模型,確定馬鞭草中總黃酮最佳提取工藝條件,實驗設計因素見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels tabe of response surface experiment

1.2.5 馬鞭草總黃酮體外抗氧化試驗

1.2.5.1 馬鞭草總黃酮對DPPH自由基清除率的測定 將馬鞭草濃縮液加無水乙醇配制成濃度分別為5、10、20、40、60、80 μg/mL的樣品溶液。精密移取2 mL樣品溶液于試管中,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL,充分混勻,室溫下避光反應30 min,以無水乙醇為空白對照,于517 nm波長處測定其吸光度[20],平行測量3次。以抗壞血酸為陽性對照,精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應濃度,按上述方法操作。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

1.2.5.2 馬鞭草總黃酮對羥自由基清除率的測定 采用鄰二氮菲法測定羥自由基的清除率,取5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.5 mL置于10 mL的具塞試管中,加入2 mL 0.75 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻后加入1 mL 0.75 mmoL/L的FeSO4溶液,充分混勻后加入1 mL不同濃度的供試液,再加入1 mL 1% H2O2溶液,然后加蒸餾水補足到10 mL,混勻,在37 ℃水浴下反應1 h,空白組既不加樣品溶液又不加H2O2,對照組加H2O2溶液而不加樣品溶液的吸光度。以于536 nm波長下測定吸光值[21]。以抗壞血酸為陽性對照,精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應濃度,按上述方法操作。

羥自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

1.3 數據處理

運用Origin 8.0及Design Expert 8.0.6軟件進行數據整理及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度的選擇 圖1表明,當乙醇濃度在30%～50%之間,馬鞭草中總黃酮含量隨乙醇濃度的增加而增大;當乙醇濃度為50%時總黃酮含量達到最大,繼續增加乙醇濃度時,總黃酮含量下降。原因可能是隨著乙醇濃度增大,黃酮類化合物達到飽和,由于醇溶性雜質“色素”等親脂性強的成分溶出量增加,與黃酮類化合物競爭同溶劑結合,從而導致黃酮的提取含量下降[23]。因此本實驗選取乙醇濃度為40%、50%、60%進行優化。

圖1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on content of total flavonoids

2.1.2 料液比的選擇 馬鞭草中總黃酮的含量隨著料液比的增加而逐漸增加且趨于平緩。原因有可能是:料液比過小,黃酮類化合物溶解不充分;料液比過大,則樣品中一些非黃酮類的化合物溶解度增大,與黃酮類化合物競爭性溶出,從而使其含量趨于平緩,由于提取液體積的增大會增加蒸發濃縮的能耗和工耗,為降低成本,因此選擇料液比1∶30、1∶35、1∶40 g/mL三個水平進行優化。

圖2 料液比對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of the ratio of water to materials on content of total flavonoids

2.1.3 提取時間的選擇 由圖4可知,在2 min時,總黃酮含量最高,在此之后總黃酮含量隨時間的延長逐步下降,原因可能是隨著時間的延長,閃式提取過程中發熱,有利于總黃酮的溶出,但是黃酮類物質在長時間高溫下會受到一定程度的破壞,因此提取量出現下降趨勢?？紤]到閃式提取一次提取時間最長不超過2 min，時間長于2 min時，需要連續多次提取，且在1 min時的總黃酮含量與2.5 min時基本上一致，故選擇提取時間1、1.5、2 min三個水平進行優化。

圖3 提取時間對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of extracting time on content of total flavonoids

2.1.4 提取次數的選擇 由圖4可知,隨著提取次數的增加,多酚的含量逐漸增大且趨于平緩,但溶劑的消耗量增大,同時增加蒸發濃縮的能耗和工耗,為降低成本,考慮到效益諸多方面的因素,故選擇提取次數為1次、2次、3次三個水平進行優化。

圖4 提取次數對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction times on content of total flavonoids

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken的中心組合原理為依據,以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為自變量,總黃酮的含量為因變量,采用4因素3水平響應面優化提取工藝,利用統計學分析軟件Design Expert8.0.6軟件建立數字回歸模型,確定馬鞭草中總黃酮最佳提取工藝條件,結果見表2。得回歸方程Y=8.13+0.32A+0.46B+0.48C+0.16D+0.39BC-1.15A2-1.06B2-1.18C2-1.13D2

表2 響應面試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 Analysis results of regression and variance

模型中因素一次項B和C,二次項A2、B2、C2和D2對馬鞭草總黃酮含量有極顯著的影響(p<0.001),一次項A、交互相BC對馬鞭草總黃酮的含量有高度顯著影響(p<0.01),一次項D對馬鞭草總黃酮的含量有顯著影響(p<0.05),各因素對馬鞭草中總黃酮含量的影響依次為:提取時間(C)>料液比(B)>乙醇濃度(A)>提取次數(D)。

2.2.2 響應面交互作用分析與優化 響應曲面坡度越陡峭,說明響應值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,該因素的改變對響應值的影響也就越小,各因素交互作用對馬鞭草中總黃酮含量影響的響應曲面以及等高線如圖5所示。提取時間和料液比兩個因素隨取值的變化,其效應曲面線變化比較陡峭,表明這兩個因素對馬鞭草總黃酮的提取的交互影響作用顯著,乙醇濃度和料液比、乙醇濃度和提取時間、乙醇濃度和提取次數、料液比和提取次數、提取時間和提取次數對總黃酮含量的交互影響作用不顯著,這與表3中交互項值的分析一致。

圖5 各因素交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface plot of interaction of various factors

2.3 最佳工藝驗證

通過回歸模型得出馬鞭草中總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度51.6%,料液比為1∶36.3 (g/mL),提取時間為1.51 min,提取次數為2次,在此條件下,總黃酮的含量為8.280 mg/g,綜合考慮將其最佳工藝條件調整為乙醇濃度50%,料液比為1∶35 (g/mL),提取時間為1.5 min,提取次數為2次,以此條件進行3次重復性試驗,測得馬鞭草中總黃酮的含量為(8.282±0.003) mg/g,RSD=0.29%,由此可說明模型和方法的可行性和有效性良好。

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力 不同濃度的馬鞭草總黃酮提取液與VC溶液對DPPH自由基清除能力如圖6所示。從圖6中可以看出,馬鞭草總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而升高,當其濃度為60 μg/mL時,清除率達到74.8%,此后,清除率基本保持不變。在實驗濃度范圍內,陽性對照物抗壞血酸在實驗濃度范圍內對DPPH自由基的清除能力始終高于馬鞭草總黃酮。

圖6 不同濃度的馬鞭草總黃酮和抗壞血酸對DPPH·的清除率Fig.6 DPPH·scavenging activities of VC and total flavonoids

2.4.2 馬鞭草總黃酮對羥自由基的清除能力 不同濃度的馬鞭草總黃酮提取液與VC溶液對羥自由基清除能力如圖7所示。馬鞭草總黃酮對羥自由基具有一定的抑制能力，但不如VC,當馬鞭草總黃酮濃度為60 μg/mL時,清除率為43.2%,此后,隨著濃度的增加,清除率基本保持不變。在實驗濃度范圍內,陽性對照物抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力始終高于馬鞭草總黃酮。

圖7 不同濃度的馬鞭草總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of VC and total flavonoids

圖8 不同濃度的馬鞭草總黃酮和抗壞血酸對自由基的清除率 activities of VC and total flavonoids

3 結論

通過采用響應面法優化馬鞭草中總黃酮的閃式提取工藝,以馬鞭草中總黃酮含量為響應值進行響應面分析,得到最佳提取工藝條件為:乙醇濃度50%,料液比為1∶35 (g/mL),提取時間為1.5 min,提取次數為2次,在此條件下,總黃酮含量達到(8.282±0.003) mg/g,與模型預測值8.280 mg/g相近。與該方法可為馬鞭草中總黃酮的研究提供一定的基礎。馬鞭草中總黃酮抗氧化活性試驗表明隨著馬鞭草中總黃酮含量的增多,其抗氧化活性在一定范圍內不斷增加,為其在食品、藥品等領域開發天然抗氧化劑提供一定的理論依據。