紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊制備工藝優化及其穩定性分析

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(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.朝陽本色有機食品有限公司,遼寧朝陽 122312; 3.鳳城市匯明農產品有限公司,遼寧丹東 118000)

紅樹莓(RubusideausL.)屬薔薇科懸鉤子屬小漿果,又稱馬林、山莓果和覆盆子等,果實營養豐富,有著“黃金漿果”美譽[1-2]。紅樹莓皮薄多汁極不易貯運,多加工成果醬、果汁和果酒等產品,紅樹莓籽多被丟棄,造成資源浪費。低聚原花青素是紅樹莓籽中主要活性成分,具有消炎、降血脂、降血糖及抗癌等功能活性[3-5]。低聚原花青素在貯藏過程中具有低穩定性和溫度敏感性[6],易受pH、溫度、光照及添加劑影響而被氧化分解,成為其產品開發難題。

微膠囊技術可將活性物質包裹于某種基質中形成微小顆粒,隔絕外界環境因素影響,提高貯存穩定性,常用方法有噴霧干燥、復凝聚及分子包埋等[7]。其中,復凝聚法制備微膠囊是將兩種帶相反電荷膠體混合,形成聚電解質復合物沉積在芯材周圍形成微膠囊[8],此法制備微膠囊條件溫和,操作簡便,產率高,且控釋特性好[9],可用于包埋低聚原花青素提高其貯存穩定性。明膠是一種帶正電荷的蛋白質,具有較好的相容性、乳化性及凝膠性[10],阿拉伯膠是一種帶負電荷的多糖,具有良好的溶解性、附著性和成膜性,兩者復合可形成凝聚物,廣泛用作微膠囊壁材[11],轉谷氨酰胺酶(Transglutaminase,TG酶)是一種安全性高、交聯作用強的新型固化劑,可廣泛用于食品行業[9]。以明膠和阿拉伯膠為壁材,TG酶為固化劑,采用復凝聚法制備低聚原花青素微膠囊,可提高低聚原花青素貯存穩定性。

近年來,微膠囊技術主要應用于植物精油的包埋,解決了植物精油應用難題。但以大分子多糖和蛋白質為壁材,通過自聚集反應包埋原花青素研究較少,對紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊化及其穩定性研究甚少。因此,本試驗以紅樹莓籽低聚原花青素為芯材,明膠和阿拉伯膠為壁材,建立響應面優化復凝聚法制備紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊工藝模型,旨在提高低聚原花青素穩定性,擴大其應用范圍。其次,將紅樹莓籽低聚原花青素及其微膠囊進行穩定性比較分析,探究外界因素對低聚原花青素穩定性影響,為其在食品領域應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅樹莓籽 大連中超食品有限公司;兒茶素 HPLC≥98%,北京索萊寶科技有限公司;明膠、阿拉伯膠、亞硫酸氫鈉、VC食品級,廣州市濤升化工有限公司;TG酶 食品級,上海康達食品工程有限公司。大孔樹脂 分析純,鄭州勤實科技有限公司;無水乙醇、石油醚、甲醇 分析純,天津市大茂化學試劑廠。

GT-100高通量組織研磨儀 北京格瑞德曼儀器設備有限公司;UV-2700紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司;FE20 pH 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;KQ-100DB數控超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司;RE-52旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;ALPH1-2LDPLUS真空冷凍干燥機 北京奧創興業有限公司;Motic BA-300數碼顯微鏡 日本麥克奧迪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅樹莓籽低聚原花青素的制備 實驗室前期研究結果表明,紅樹莓籽低聚原花青素制備條件如下:將水分含量為3.8%的紅樹莓籽研磨過60目篩,采用石油醚在料液比1∶10 g/mL,溫度40 ℃條件下脫脂4 h,抽濾干燥后得到紅樹莓籽脫脂粉。紅樹莓籽脫脂粉在乙醇濃度80%、料液比1∶15 g/mL、溫度50 ℃下恒溫振蕩提取1 h后,抽濾得到紅樹莓籽原花青素提取液,提取液在55 ℃下旋蒸至無醇味后,冷凍干燥得到紅樹莓籽原花青素粗提物。紅樹莓籽原花青素粗提物經HPD100大孔樹脂吸附飽和后,采用40%乙醇洗脫后,經旋蒸及冷凍干燥即得到紅樹莓籽低聚原花青素,純度為52.36%。

1.2.2 壁材凝聚工藝參數的選擇 一定質量分數的明膠與阿拉伯膠按一定質量比于60 ℃水浴中混勻,10%醋酸溶液調pH至3.4,300 r/min攪拌反應30 min;15 ℃冰浴下加入25 g/100 g明膠的TG酶固化15 min[12]。

1.2.2.1 壁材濃度選擇 參考蓋旭等[13]方法并略有改動,在壁材質量比(明膠∶阿拉伯膠)1∶1條件下,考察壁材濃度分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%時成囊效果,根據電子顯微鏡成囊效果圖選取最佳壁材濃度。

1.2.2.2 壁材質量比選擇 參考韓路等[14]方法并略有改動,在壁材濃度0.75%條件下,考察壁材質量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3時對380 nm處透光率影響,根據透光率選取最佳壁材質量比。

1.2.3 紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊制備的單因素實驗 分別將質量分數為0.75%的明膠和阿拉伯膠于60 ℃下攪拌溶解;將明膠溶液與一定量的紅樹莓籽低聚原花青素混勻,3000 r/min條件下攪拌1 min后,置于45 ℃水浴中,緩慢加入與明膠等質量的阿拉伯膠溶液混勻,10%醋酸溶液調pH至3.4,300 r/min攪拌反應30 min;一定溫度下加入TG酶固化15 min,靜置、沉降、蒸餾水洗滌2次、抽濾、真空冷凍干燥得到紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊樣品。

1.2.3.1 芯壁質量比選擇 在TG酶添加量25 g/100 g、明膠及固化溫度15 ℃條件下,考察芯壁質量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3對微膠囊化影響,根據包埋率和產率選取最佳芯壁質量比。

1.2.3.2 固化溫度選擇 在芯壁質量比1∶1及TG酶添加量25 g/100 g明膠條件下,考察固化溫度分別為5、10、15、20、25 ℃對微膠囊化影響,根據包埋率和產率選取最佳固化溫度。

1.2.3.3 TG酶添加量選擇 在芯壁質量比1∶1及溫度15 ℃條件下,考察TG酶添加量分別為15、20、25、30、35 g/100 g明膠對微膠囊化影響,根據包埋率和產率選取最佳TG酶添加量。

1.2.4 響應面優化微膠囊制備試驗 在單因素實驗基礎上,采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設計優化試驗,以芯壁質量比(A)、固化溫度(B)、TG酶添加量(C)為因素,包埋率為響應值,因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.5 微膠囊包埋率及產率計算

1.2.5.1 低聚原花青素標準曲線繪制 稱取兒茶素標準品5 mg,甲醇定容至25 mL,分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、l.0 mL于試管中,甲醇分別定容至1 mL,各加入5 mg/mL香草醛-甲醛溶液6 mL和濃鹽酸3 mL,搖勻,30 ℃水浴避光1 h,以甲醇為空白,測定500 nm處吸光值[15-16],以兒茶素質量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制的標準曲線為y=0.0012x-0.0028,R2=0.9993。

1.2.5.2 紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊包埋率及產率計算 稱取25 mg微膠囊樣品于無水乙醇中,反復振蕩洗滌,過濾,濾液定容至25 mL,濾液中低聚原花青素含量即為表面原花青素含量;稱取25 mg微膠囊樣品于蒸餾水中,反復振蕩洗滌,過濾,濾液定容至25 mL,濾液中低聚原花青素含量即為產品總低聚原花青素含量[17]。微膠囊包埋率反映了紅樹莓籽低聚原花青素被包埋程度,見公式(1);微膠囊化產率反映了紅樹莓低聚原花青素微膠囊制備過程中低聚原花青保留情況[18],見公式(2),包埋率和產率變化呈正相關[19]。

包埋率(%)=[1-(微膠囊表面低聚原花青素質量/微膠囊總低聚原花青素含量)]×100

式(1)

式(2)

1.2.6 低聚原花青素微膠囊理化特性測定 水分含量測定參照GB 5009.3-2016[20],休止角測定參照劉安然[21]的方法,溶解度測定參照夏慧亭等[17]的方法,粒徑測定參照廖霞等[22]的方法。

1.2.7 低聚原花青素及其微膠囊穩定性比較

1.2.7.1 VC和亞硫酸氫鈉對低聚原花青素穩定性影響 取0.025 g紅樹莓籽低聚原花青素及其微膠囊各12份,分別加入20 mL 0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% VC溶液和亞硫酸氫鈉溶液中,50 ℃水浴40 min后,測定低聚原花青素含量。

1.2.7.2 溫度對低聚原花青素穩定性影響 取0.025 g紅樹莓籽低聚原花青素及其微膠囊各5份,分別置于10、30、50、70、90 ℃恒溫干燥箱內加熱60 min,分別測定低聚原花青素含量。

1.2.7.3 pH對低聚原花青素穩定性影響 取0.025 g紅樹莓籽低聚原花青素及其微膠囊各5份,分別加入20 mL的pH為2、4、6、8、10磷酸鹽緩沖溶液,30 ℃下水浴2 h,分別測定低聚原花青素含量。

1.2.7.4 光照時間對低聚原花青素穩定性影響 分別取0.025 g紅樹莓籽低聚原花青素及其微膠囊各5份,置于1.0×105Lx光照培養箱中,每隔1.5 h取出一份,測定低聚原花青素含量。

1.2.7.5 紅樹莓籽低聚原花青素保留率測定 參照廖霞等[23]的方法,低聚原花青素保留率計算見公式(3)。

式(3)

1.2.8 數據處理 實驗均重復3次,采用“平均值±標準差”形式,采用Microsoft Word 2003軟件對數據進行整理繪圖,SPSS 22.0軟件對數據進行顯著性分析,顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 壁材凝聚工藝參數確定

2.1.1 壁材濃度對微膠囊成囊效果的影響 壁材濃度成囊效果如圖1所示,壁材濃度在0.25%～0.50%時,成囊數量較少,包埋效果不夠明顯;當壁材濃度為0.75%時,成囊效果明顯,呈現較多均勻球形囊狀物;當壁材濃度增大至1.00%時,由于壁材濃度過大,視野較模糊,出現囊狀物黏連現象,外殼穩定性較差,不利于包埋;當壁材濃度增大至1.25%時,壁材大量結塊,聚集形成凝膠狀態,基本不能包埋芯材。故選取最適壁材濃度為0.75%。

圖1 不同壁材濃度微囊電子顯微鏡形態觀察(400×)Fig.1 Morphology of microcapsules in different wall material concentrations by electron microscopy(400×)

2.1.2 壁材質量比對微膠囊化影響分析 明膠與阿拉伯膠不同質量比對透光率影響如圖2所示,壁材溶液透光率越低,復凝聚效果越好,即微膠囊化程度越高[14]。當壁材質量比在3∶1～1∶1時,壁材透光率顯著下降(p<0.05);當壁材質量比為1∶1時,溶液透光率最小,明膠與阿拉伯膠混勻后,溶液正負電荷數目恰當時,可完全發生復凝聚反應,溶液呈乳濁液,透光率最低[13];當壁材質量比在1∶1～1∶3時,壁材透光率顯著上升(p<0.05)。因此,選取最佳壁材質量比為1∶1。

圖2 壁材質量比對透光率的影響Fig.2 Effect of wall material mass ratios on light transmittance注:不同小寫字母表示同一指標不同實驗組數據差異顯著(p<0.05);圖3～圖5、圖7～圖10同。

2.2 紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊制備單因素實驗結果

2.2.1 芯壁質量比對低聚原花青素微膠囊化的影響 芯壁質量比對低聚原花青素微膠囊包埋效果影響如圖3所示,芯壁質量比在3∶1～1∶1時,微膠囊包埋率及產率均顯著升高(p<0.05),是因芯材濃度過高,壁材不能完全將芯材包裹,包埋率和產率相對較低;當芯壁質量比在1∶1～1∶3時,微膠囊包埋率及產率均無顯著性變化(p>0.05),但包埋率有緩慢下降趨勢,是因壁材濃度過高易聚集黏連,微囊形狀不穩定[22]。因此,選擇最適芯壁質量比為1∶1。

圖3 芯壁質量比對微膠囊包埋效果影響Fig.3 Effect of core/wall material ratio on the embedding efficiency and yield of microcapsules

2.2.2 固化溫度對低聚原花青素微膠囊化的影響 固化溫度對低聚原花青素微膠囊包埋效果影響如圖4所示,當溫度在5～10 ℃時,包埋率及產率顯著升高(p<0.05),是因為當固化溫度過低時,壁材交聯作用弱,同時TG酶活性受到抑制;固化溫度在10 ℃時,微膠囊包埋率及產率均達到最大值;當溫度在10～25 ℃時,隨溫度升高微膠囊包埋率下降顯著(p<0.05),是因固化溫度過高,微膠囊質地較軟,壁材凝膠性降低[12]。產率在10～15 ℃時下降差異不顯著(p>0.05),而15～25 ℃時下降差異顯著(p<0.05),綜上所述,選取最佳固化溫度為10 ℃。

圖4 固化溫度對微膠囊包埋效果影響Fig.4 Effect of curing temperature on the embedding efficiency and yield of microcapsules

2.2.3 TG酶添加量對低聚原花青素微膠囊化的影響 TG酶添加量對微膠囊包埋效果影響如圖5所示,當TG酶添加量在15～25 g/100 g明膠時,包埋率和產率顯著升高(p<0.05),是由于酶量過低時,壁材間蛋白質分子共價鍵形成較少,交聯不完全[24];當TG酶添加量為25 g/100 g明膠時,微膠囊包埋率及產率最高,是因壁材與TG酶作用位點充分結合[12];當TG酶添加量在25～35 g/100 g明膠時,包埋率顯著下降(p<0.05),但產率無顯著性變化(p>0.05),是因為壁材發生粘連,不利于芯材包埋。因此,選取最佳TG酶添加量為25 g/100 g明膠。

圖5 酶添加量對微膠囊包埋效果影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the embedding efficiency and yield of microcapsules

2.3 響應面優化試驗結果分析

2.3.1 模型建立與顯著性分析 根據表1響應面因素與水平,通過Box-Behnken設計得到17組試驗,方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results for response surface experiment

表3 模型回歸系數顯著性檢驗結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.2 響應面交互作用分析 各因素交互作用對紅樹莓籽低聚原花青素包埋率影響的等高線和響應面圖見圖6,響應面坡度越陡峭,等高線越扁,且排列越密集,均說明微膠囊包埋率對各因素變化較敏感,影響顯著。由圖6a、c和e等高線圖可知,AC和BC等高線圖形相對AB較扁,且BC等高線較密集,故交互項對微膠囊包埋率影響大小依次為BC>AC>AB,BC和AC對微膠囊包埋效果影響極顯著,AB影響顯著,與模型系數顯著性檢驗結果一致。由圖6b、d和f可知,當其它因素取零水平時,隨芯壁質量比、固化溫度及酶添加量單一變量的增大,微膠囊包埋率均呈先升高后降低趨勢,故在且所選因素參數范圍內均存在極值,可對紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊化最佳工藝進行預測。

圖6 各因素間交互作用對紅樹莓籽低聚原花青素得率的等高線和響應面圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of red raspberry seed on dissolution quantity of flavonoids

2.3.3 驗證試驗結果分析 由模型預測出紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊化最優工藝條件為:芯壁質量比1.048∶1,固化溫度9.79 ℃,TG酶添加量22.39 g/100 g明膠,理論包埋率80.91%。考慮實際條件,參數調整為:芯壁質量比1.05∶1,溫度10 ℃,TG酶添加量22.39 g/100 g明膠。進行3組平行驗證試驗,微膠囊包埋率分別為81.23%、79.02%、80.78%,平均值80.34%,與理論值相對誤差1.04%<5%,說明結果可靠。

2.4 紅樹莓籽低聚原花青微膠囊理化特性分析

微膠囊水分含量越低越利于貯存,溶解度越高,平均粒徑越小,微膠囊越易溶于水且分布均勻,休止角高于30°則微膠囊流動性較好[22]。紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊水分含量、溶解度、平均粒徑和休止角分別為5.64%、89.64%、476 nm和36.4 °,說明微膠囊產品具有較好的貯存性、溶解性和流動性。

2.5 紅樹莓籽低聚原花青及其微膠囊穩定性比較分析

2.5.1 VC、亞硫酸氫鈉對低聚原花青及其微膠囊穩定性的影響 VC和亞硫酸氫鈉對紅樹莓籽低聚原花青素保留率影響如圖7所示,隨VC和亞硫酸氫鈉濃度升高,紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊及未包埋低聚原花青素穩定性均提高,這可能是由于引入氫離子或鈉離子,對低聚原花青素結構產生影響,使低聚原花青素結構更加穩定,不易受外界因素影響[25]。說明VC和亞硫酸氫鈉對低聚原花青素穩定性有一定促進作用,但低聚原花青素微膠囊可較大程度提高其保留率。

圖7 VC和亞硫酸氫鈉對微膠囊保留率的影響Fig.7 Effect of VC and sodium bisulfite on the stability of native and microencapsulated oligomeric proanthocyanidins

2.5.2 溫度對低聚原花青素及其微膠囊穩定性的影響 溫度對紅樹莓籽低聚原花青素保留率影響如圖8所示,在10～90 ℃內,低聚原花青素微膠囊及未包埋低聚原花青素保留率均顯著下降(p<0.05),說明溫度對低聚原花青素影響較大。其次,微膠囊中低聚原花青素保留率較高,是因氧氣需通過囊壁微孔才能與低聚原花青素接觸,避免低聚原花青素直接暴露于高溫下,提高了低聚原花青素穩定性[26]。因此,微膠囊化能夠在一定程度上提高低聚原花青素的耐熱性。

圖8 溫度對微膠囊保留率的影響Fig.8 Effect of temperature on the stability of native and microencapsulated oligomeric proanthocyanidins

2.5.3 pH對低聚原花青素及其微膠囊穩定性的影響 pH對紅樹莓籽低聚原花青素保留率影響如圖9所示,pH在2～6內,低聚原花青素保留率均顯著升高(p<0.05);pH在6～10內,低聚原花青素保留率均逐漸下降,是因低聚原花青素在強酸或強堿環境下結構易被破壞,弱酸性下較穩定[27]。微膠囊中低聚原花青素保留率較高,是因低聚原花青素被壁材包裹,避免其與環境直接接觸,說明將紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊化可提高其酸堿穩定性。

圖9 pH對微膠囊保留率的影響Fig.9 Effect of pH on the stability of native and microencapsulated oligomeric proanthocyanidins

2.5.4 光照對低聚原花青素及其微膠囊穩定性的影響 光照時間對紅樹莓籽低聚原花青素保留率影響如圖10所示,隨光照時間增加,低聚原花青素保留率均顯著下降(p<0.05),說明低聚原花青素在光照下易分解。微膠囊中低聚原花青素保留率較高,是因為微膠囊避免了低聚原花青素與光照直接接觸,故微膠囊化可以提高低聚原花青素的光照穩定性。

圖10 光照時間對微膠囊保留率的影響Fig.10 Effect of light time on the stability of native and microencapsulated oligomeric proanthocyanidins

3 結論

通過單因素及響應面試驗得到復凝聚法制備紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊工藝,最優工藝參數為壁材濃度0.75%、壁材質量比(明膠∶阿拉伯膠為1∶1)、芯壁質量比1.05∶1、固化溫度10 ℃、TG酶添加量22.39 g/100 g明膠,此條件下包埋率80.34%;微膠囊水分含量為5.64%,休止角36.4°,溶解度為89.64%，平均粒徑為476 nm,具有較好的貯藏性、流動性和溶解性;紅樹莓籽低聚原花青素及其微膠囊穩定性分析表明,在VC、亞硫酸氫鈉、溫度、pH及光照等因素作用下,包埋后的低聚原花青素保留率較高。因此,將紅樹莓籽低聚原花青素微膠囊化,有效地增強了其耐熱性、耐酸堿性及耐光性,擴大了低聚原花青素應用范圍,并為其廣泛應用提供理論依據。