熱壓結合處理對低溫火腿中耐壓腐敗菌的抑制作用

,,,,,,,,*

(1.南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室,江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 210095; 2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014; 3.江蘇雨潤肉食品有限公司,肉品加工與質量控制國家重點實驗室,江蘇南京 211806)

低溫肉制品是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等熱加工過程使肉制品的中心溫度控制在68～72 ℃,并且需要在0～4 ℃的低溫環境下貯藏、運輸及銷售的一類肉制品[1]。其中,低溫火腿因其營養豐富、味道鮮嫩等特點,深受消費者的喜愛,但其加工溫度較低可能會導致殺菌不徹底,嚴重影響該類產品的貨架期,制約低溫火腿產品的發展[2]。

研究表明,使用超高壓技術可以使低溫火腿產品中大部分初始腐敗微生物[3]失去活性,但是也存在一些耐壓菌如腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)等[4],這兩種菌普遍存在于低溫肉制品中[5],且具有抵抗外界很多不利條件的能力,例如耐有機酸、乳酸鏈球菌素等。熱壓結合處理滅菌(High pressure thermal sterilization treatment,HPTS)是熱處理協同超高壓處理技術,既可以降低超高壓處理的壓力和時間[6],又能有效保護肉品營養價值和其質構特性[7]。研究證明,HPTS技術可以有效滅菌[8]和滅活芽孢[9-10],實際生產中多應用于殺滅牛奶、飲料等中的芽孢菌,在肉制品領域的研究仍有待深入。

本文以低溫火腿中最主要的兩個耐壓腐敗菌——綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌為研究對象,采用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)和流式細胞技術(FCM)研究經熱壓結合處理(處理條件參照文獻[11])的細胞形態、內部結構和細胞生理狀態的變化,同時結合核酸、蛋白質流失探究細胞膜的完整性的破壞,從而探討熱壓結合處理對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的細胞膜的影響,旨在為熱壓結合處理應用于肉品殺菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色魏斯菌(GU458345)、腸膜明串珠菌(GU458344) 江蘇雨潤肉食品有限公司肉品加工與質量控制國家重點實驗室保藏;MRS肉湯培養基(MRS Broth):蛋白胨10.0 g/L,牛肉粉 8.0 g/L,酵母粉4.0 g/L,葡萄糖 20.0 g/L,磷酸氫二鉀 2.0 g/L,檸檬酸氫二銨 2.0 g/L,乙酸鈉 5.0 g/L,硫酸鎂 0.2 g/L,硫酸錳 0.04 g/L,吐溫80 1.0 g/L;平板計數瓊脂(PCA):胰蛋白胨 5.0 g/L,酵母浸粉 2.5 g/L,葡萄糖1.0 g/L,瓊脂15.0 g/L;1,2-丙二醇(分析純) 上海泰坦科技股份有限公司;LIVE/DEAD? BacLight細菌細胞活性測定試劑盒(LIVE/DEAD? BacLight Bacterial Viability Kits) 美國英韋創津公司。

SPF-S-1L-100-850-9-W 型超高壓處理裝置 英國Stansted Fluid Power公司;AUY120型電子分析天平 日本SHIMADZU公司;MUL-9000系列純水機 美國密理博公司;M2e多功能酶標儀 德國MD公司;Hitachi SU8010冷場發射掃描電鏡 日本日立公司;H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司;Accuri C6流式細胞儀 美國BD公司;Bioscreen C FP1100-C全自動細菌生長記錄儀 芬蘭Bioscreen公司;Scan1200自動影像分析菌落計數器 法國Interscience公司;NanoDrop 2000微量紫外分光計 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 無菌挑取凍存于-80 ℃的菌種,接種于新鮮的MRS肉湯培養基中,30 ℃培養活化,重復以上步驟進行第2次活化之后,收集培養至穩定期的菌體,6000 r/min、4 ℃條件下離心2 min,棄除上清液,用生理鹽水重復離心洗滌菌體沉淀3次,最后制成109CFU/mL菌懸液,一部分封裝于無菌的包裝袋中熱封口,4 ℃條件冷藏以備熱壓結合處理;另一部分收集至無菌的離心管中,4 ℃冷藏。

1.2.2 熱壓結合處理 將裝有菌懸液的包裝袋置于超高壓加壓釜中,放入超高壓儀器中[12],處理壓力為350 MPa,保壓處理10 min(處理時間不包括升壓和卸壓所需時間),處理介質為丙二醇,溫度為50 ℃,每個樣品做3次平行。

1.2.3 微生物計數

1.2.3.1 計數方法 將經過1.2.2熱壓結合處理后的菌懸液,各處理樣(兩重復)無菌取樣1 mL進行梯度稀釋,選擇合適的稀釋度,采用平板涂布計數法進行菌落總數的測定。未處理樣品用MRS培養基,熱壓結合處理后樣品采用薄層平板(TAL)計數。

TAL平板制備:在無菌平板上事先倒入約25 mL MRS瓊脂培養基,待培養基冷卻后,再向凝固的MRS培養基表面小心倒入約14 mL的PCA培養基,紫外燈下待凝固備用。

1.2.3.2 細菌的存活率計算 存活率=lg(N/N0),其中N0和N分別代表處理前和處理后的菌落數(CFU/mL)[13]。

1.2.4 熱壓結合處理前后的生長曲線的測量 吸取200 μL經過1.2.2熱壓結合處理的菌懸液于蜂窩板內,初始濃度為2%,每組設置3個平行孔。置于30 ℃下培養。將蜂窩板置于全自動細菌生長記錄儀中,設置從0 h開始,每隔2 h測一次OD600值[14]。對照組為初始濃度為2%的未經過處理的菌懸液,以MRS培養基為空白。

1.2.5 掃描電鏡和對細胞形態結構的觀察 將經過1.2.2熱壓結合處理的菌懸液,6000 r/min、4 ℃離心2 min收集菌體,加入1 mL預冷的2.5%的戊二醛溶液,4 ℃條件下固定8 h以上,磷酸緩沖液(PBS,pH=7.4)漂洗3次,每次30 min,再依次經30%、50%、70%和90%的乙醇梯度脫水各15 min后,再用100%的乙醇脫水兩次,每次15 min[15]。脫水后樣品用叔丁醇置換3次,每次30 min,置換后的樣品進行冷凍干燥(溫度為-80 ℃，真空度為0.1 mbar),離子濺射儀鍍金(厚度約10 nm),掃描電鏡觀察菌體結構變化,對照組為未處理的菌懸液。

1.2.6 透射電鏡對細胞超微結構的觀察 將經過1.2.2熱壓結合處理的菌懸液,6000 r/min、4 ℃離心2 min收集菌體,加入1 mL左右預冷的2.5%戊二醛溶液,4 ℃條件下固定8 h以上。固定后室溫下800 r/min離心30 s,棄上清液,加入40 ℃左右的1%瓊脂,迅速攪拌后室溫下800 r/min離心30 s冷卻成團,前部含樣品瓊脂切成小塊再加入戊二醛固定,再以PBS(pH=7.2的0.2 mol/25 L磷酸緩沖液)重懸浮,重復3次,最后以PBS重懸。分別用30%、50%、70%、80%、90%梯度濃度酒精脫水,再用純酒精脫水3次,然后用純叔丁醇置換酒精3次,每個步驟各15 min。置換后的樣品進行冷凍干燥(溫度為-80 ℃，真空度為0.1 mbar),最后將冷凍干燥后的樣品離子電流鍍金,在透射電鏡下觀察并拍照[16-17]。設置對照組為未處理的菌懸液。

1.2.7 流式細胞儀分析 本研究利用SYTO9/PI染料(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit,Invitrogen)對所收集的細菌細胞進行染色,后利用流式細胞儀分析細菌細胞的死亡、受損及活細胞的比例。

將制備好的菌懸液經過1.2.2熱壓結合處理,6000 r/min、4 ℃條件下,離心2 min收集菌體,生理鹽水洗脫3次后,加入SYTO9/PI染液(3 μL,比例為1∶1),室溫下,避光孵育15 min[18-19],上機檢測,檢測激發光為488 nm,SYTO9染料為FL1檢測通道,PI為FL3檢測通道,計數10000個細胞。將100 ℃處理30 min的樣品作為PI陽性對照,未經過處理的樣品作為SYTO9陽性對照。

1.2.9 熱壓結合處理后細菌細胞內核酸、蛋白質泄漏量的測定 將經過1.2.2熱壓結合處理的菌懸液于4 ℃、4000 r/min離心15 min,收集上清液,使用微量分光光度計測定260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質)處的吸光值[20-21],每組設置3個平行,對照組為未處理的菌懸液,空白為生理鹽水。

1.3 數據處理與統計分析

本實驗數據統計采用SAS 8.0進行成組t檢驗(p<0.05),數據以均值±標準差表示,采用Excel 2016進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 熱壓結合處理對兩種耐壓菌存活率的影響

通過測量兩種菌的存活率來探究熱壓結合殺菌的效果。由表1可以看出熱壓處理后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的存活率為-4.74和-6.61lg(CFU/mL),綠色魏斯菌的存活率略高于腸膜明串珠菌,說明熱壓結合處理雖不能達到完全殺菌的效果,但能夠有效降低這兩種菌的存活率,可以起到抑制細菌的作用。由于微生物經受不利條件(超高靜壓、凍融、熱處理、超聲波、輻照、微波等)后存在損傷修復現象,這種受傷狀態的微生物以傳統培養方法無法檢測,針對這種情況,采用薄層平板培養方法(thin agar layer,TAL)[22]能較為準確計數,在流式細胞技術結果中顯示存在損傷細胞,因此測定經過熱壓結合處理后的菌落總數使用TAL培養基。

表1 經過熱壓結合處理后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的存活率Table 1 Survival rate of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides under HPTS treatment

2.2 熱壓結合處理對兩種菌的生長特性的影響

通過測量兩種菌熱壓結合處理前后的生長曲線研究細胞的生長情況。經熱壓結合處理后,兩種菌的生長曲線如圖1所示。圖1A中,綠色魏斯菌正常菌株在0 h后進入對數期,在18 h后進入穩定期,OD600值為1.246;熱壓結合處理后細菌在4 h后進入對數期,在第24 h達到穩定期,細菌OD600值達到1.235。圖1B中,腸膜明串珠菌正常菌株在0 h后進入對數期,第14 h后進入穩定期,OD600值為1.28;熱壓結合處理后細菌從16 h后進入對數期,在第38 h達到穩定期,細菌OD600值達到1.289。

圖1 熱壓處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS注:A為綠色魏斯菌,B為腸膜明串珠菌。

兩種耐壓菌在熱壓結合處理后都停止了生長繁殖,經歷了一段時間的復蘇才能正常進行增殖,綠色魏斯菌的遲緩期變為4 h,腸膜明串珠菌的遲緩期變為16 h,且經過復蘇后,受損細胞的生長曲線與正常細菌的相近。熱壓處理后的綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌在對數期的生長速率略低于正常細菌,因此達到穩定期的時間變長,綠色魏斯菌整個對數期的時長從18 h變成20 h,腸膜明串珠菌從14 h變成22 h。兩種菌增殖后的受損細菌濃度與正常細菌濃度都基本一致,說明熱壓結合處理對兩種菌的生長起到了抑制的效果,但并沒有最終完全殺死細菌,只對細菌的生長有延緩作用,在營養充足、條件適宜的情況下，細菌會緩慢恢復正常的生長繁殖過程。

2.3 熱壓結合處理對細胞形態和超微結構的影響

通過掃描電鏡可以直觀的觀察細菌形態的變化。由圖2看出,熱壓結合處理前的綠色魏斯菌呈短桿狀,腸膜明串珠菌呈球狀,兩者細胞膜結構完整光滑。熱壓結合處理后,兩種菌細胞外形都有輕微變形,有明顯凹陷。這表明熱壓結合處理會導致細胞外形的改變,細胞膜本身因為磷脂雙分子結構具有一定的流動性和彈性[23-24],但在細菌接受熱壓結合處理到用戊二醛固定的一段時間里,細胞膜上的凹陷沒有回彈,即熱壓結合處理會對細胞膜的彈性和流動性造成破壞。但是細胞整體形態完整,說明熱壓結合處理并沒有能夠完全破碎這兩種耐壓菌,它們的細胞膜雖然有些變形,但是依然抵抗住了大部分的高壓和熱處理,可以推測這兩種菌的耐壓耐熱性來自于細胞膜的防護能力。

圖2 熱壓結合處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM)examination of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS注:A為綠色魏斯菌,B為腸膜明串珠菌;A-1和B-1為未處理樣,A-2和B-2為處理樣。

透射電鏡圖直觀地反映了熱壓結合處理對綠色魏斯菌細胞和腸膜明串珠菌的超微結構變化。由圖3可以看出,未處理的綠色魏斯菌呈短桿狀,腸膜明串珠菌呈圓球狀,細胞壁結構完整光滑,細胞內物質分布均勻。經熱壓結合處理后,細菌細胞有一定程度的變形,細胞內細胞質局部皺縮,出現團狀聚集和透電子區[25](圖中箭頭標記區域即為透電子區)，細胞內含物結構紊亂,胞漿蛋白凝固、核酸變性,但是細胞形態結構基本完整。從以上細菌細胞受損情況分析,熱壓結合處理引起的細胞內含物質變性凝固是導致微生物死亡的關鍵原因。

圖3 熱壓結合處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy(TEM)examination of Weissella viridescensand Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS 注:A為綠色魏斯菌,B為腸膜明串珠菌;A-1和B-1為未處理樣,A-2和B-2為處理樣。

掃描電鏡和透射電鏡結果表明，熱壓結合處理會對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的細胞膜形態和內部微觀結構都產生了影響。

2.4 熱壓結合處理對細胞生理狀態的影響

圖4中P1區域為SYTO9陽性對照,此區域代表細菌細胞膜完整,為活細胞所在區域;P2區域為PI陽性對照,此區域細菌細胞膜獲得全透性,為死亡細胞所在區域;P3區域介于P1和P2區域之間,此區域細菌細胞膜處于完整和全透之間,可以認為是受損細胞所在區域,這部分細菌處于亞致死狀態。根據圖4流式細胞儀分析死亡、受損及完整細胞時發現,綠色魏斯菌熱壓結合處理后,94.3%細胞處于P1區域,受損細胞的比例達到5.0%,只有極少部分細胞細胞膜通透性略有提高,處于P3區域內。腸膜明串珠菌熱壓結合處理后,P3區域受損細胞的比例達到99.3%,P1和P2區域幾乎沒有,這表明熱壓結合處理后,腸膜明串珠菌的細胞膜通透性發生明顯改變,但沒有達到全透性。

近年來，流式細胞技術因其快速準確的單細胞分析能力,在微生物領域受到廣泛關注。相對于傳統方法的宏觀測量,流式細胞術與各種熒光染料結合能更好地從微觀角度了解細菌的單細胞狀態,如檢測細胞周期變化、細胞數量及其群體結構變化,其檢測的標準主要是基于對于細胞膜完整性的反應,可區分反應過程中的細胞狀態(活細胞、受損細胞和死亡細胞)[26-27]。流式細胞技術在染色步驟使用的染料是實現其各種功能的關鍵。本實驗采用了SYTO9和PI復染來研究細胞生理狀態。PI染料不能透過完整細胞膜,因此只會對細胞膜破損的細胞染色,而SYTO9染料可以對所有細胞染色,但當PI染料存在時會被減弱熒光強度,因此通過熒光強度的差別可以較清晰的區別細胞膜損傷程度,完整細胞的SYTO9通道熒光信號最強,而死亡的細胞PI通道熒光信號最強,熒光信號介于兩者之間的可以定位為處于亞致死狀態的細胞。

結果顯示,綠色魏斯菌熱壓結合處理后,大部分細胞膜通透性與活細胞相同,與韓衍青的結果基本一致[4],這表明綠色魏斯菌的細胞膜通透性未發生明顯改變,大部分仍與活細胞細胞膜通透性相同,只有極少部分通透性略有提高。腸膜明串珠菌熱壓結合處理后,細胞膜通透性發生明顯改變,但沒有達到全透性,細胞膜通透性處于受損細胞的區域內,即亞致死狀態。兩種菌在熱壓結合處理后細胞膜都未獲得全透性,這可能是熱壓結合處理只能抑制細菌生長而不能完全將其殺死的一個重要原因。因流式細胞計數得到的細菌數量普遍高于普通平板計數方式[4],故此實驗得到的活細胞比例高于平板計數,可能是有一部分處于亞致死狀態的細菌細胞膜受損不嚴重,PI染料未能進行染色,但其雖暫時具有活性,卻不可培養[28]。兩種菌的流式細胞數據也能看出熱壓結合處理對腸膜明串珠菌的效果優于綠色魏斯菌,這種差異與平板計數得到的存活率結果相符,說明細胞膜通透性的改變與熱壓結合殺菌效果有直接關系。這些都說明這兩種菌細胞膜的防護作用是其耐壓耐熱的主要原因。

2.5 熱壓結合處理對胞內核酸、蛋白質泄漏量的影響

表2可知,經熱壓結合處理的兩種菌上清液中核酸(260 nm)、蛋白質(280 nm)兩種物質的含量極顯著增加(p<0.001),綠色魏斯菌熱壓結合處理后A260和A280分別增加了0.3952和0.1124,腸膜明串珠菌熱壓結合處理后A260和A280分別增加了0.2094和0.0972。說明熱壓結合處理會導致細胞膜通透性變大,使得一些蛋白質和核酸物質流出細胞外。

表2 熱壓結合處理前后綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的紫外吸收物質泄漏量Table 2 UV-absorbing substances leaking of Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides untreated and treated by HPTS

由于核酸的組成中含有嘌呤、嘧啶堿基,蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環,這些結構都具有共軛雙鍵(—C—C=C—C=C—),所以在紫外光區有強烈的光吸收作用,核酸和蛋白質的最大吸收峰分別在260、280 nm附近。因此可通過測定260、280 nm處的紫外吸收強度來確定細胞內核酸和蛋白質物質的泄漏情況[29]。但是超高壓和熱處理都會對核酸造成變性,堿基暴露,使其在260 nm處吸光度增加[30],故兩種菌在260 nm處的吸光度增加量不能定量比較,即不能比較兩種菌核酸流失量的多少,只能定性地說熱壓結合處理造成兩種菌的核酸流失。同時,這兩種菌作為原核生物缺少核膜,所以重要的遺傳物質和功能性蛋白的流失將極大影響其正常代謝。而有些受損情況較輕的細胞經過復蘇恢復成正常細胞,這些細胞可能細胞膜破損情況較輕,只有少數質粒等核酸物質流失[31],并沒有影響到細胞最根本的功能,只是失去了某些特性,而細胞膜受損情況較重的細胞因失去了大量與代謝、遺傳相關的生物大分子,最終只能死亡。綠色魏斯菌細胞膜受到的損傷較小,細胞膜完整性基本保持,能更好地進行復蘇,而腸膜明串珠菌的損傷較為嚴重,復蘇需要更長的時間,甚至有的細胞不能復蘇只能死亡。故細胞膜通透性改變導致的核酸蛋白的流失也是熱壓結合處理能滅菌的重要原因,但細胞膜通透性的改變才是最主要的因素。

3 結論

本文研究了熱壓結合處理對綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的抑制作用,結果發現,細胞形態結構的變化、細菌細胞膜通透性增大和核酸、蛋白質的流失是熱壓結合處理抑制耐壓微生物的重要原因,其中細胞膜通透性的改變是主要原因。正因為細胞膜的耐熱耐壓特性,使得熱壓結合處理不能完全殺滅細菌,只能使其進入一種亞致死狀態。熱壓結合處理可以有效地抑制耐壓菌的活性,延緩兩種耐壓菌株的生長,但不能起到完全滅菌的效果,所以需要探究如何更有效地破壞這兩種菌的細胞膜,尋求更優的滅菌條件及滅菌方式。