基于高通量測序的江西特色發(fā)酵豆豉中微生物群落多樣性及其特征分析

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(1.江西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,江西南昌 330004; 2.廈門醫(yī)學院,福建廈門 361023; 3.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

豆豉是一類利用微生物發(fā)酵黃豆或黑豆等原料而成的傳統(tǒng)調(diào)味副食品。豆豉歷史悠久,可追溯至兩千余年前的先秦時代,且分布廣泛,至今依然在我國江西[1]、云南[2]、湖南[3]、湖北[4]等地區(qū)及日本[5]、韓國[6]、印度[7]、泰國[8]、馬來西亞[9]等國家被人們制作食用。其中,江西豆豉精選優(yōu)質(zhì)黑豆,經(jīng)洗豆、泡豆、瀝干蒸制、冷卻接種、制曲及二次發(fā)酵而成,以江西南昌稻香園豆豉為典型代表,具有“顆粒完整、烏黑油亮、豉肉酥松、豉香濃郁”等特點,歷來是我國江南百姓青睞的地方風味特產(chǎn),也是藥食兩用淡豆豉的典型代表。然而,由于氣候、水土環(huán)境、風味偏好等因素不同,各地的豆豉微生物種類組成差異明顯,極具地方特色。按照制曲及發(fā)酵過程及終成品的微生物區(qū)分,豆豉大致分為細菌、曲霉、毛霉、根霉和脈孢菌型等[10]。

傳統(tǒng)發(fā)酵類食品的微生物群落組成之前通常采用富集分離培養(yǎng)鑒定的方式分析,由于技術(shù)本身的局限,即使選擇更多的培養(yǎng)基和分離條件,也僅能分離出少量優(yōu)勢菌群,不能反映其微生物群落的確切組成[2]。隨著低成本高通量測序服務的飛速發(fā)展,其在傳統(tǒng)發(fā)酵類食品如豆豉中也得以越來越多地應用。第二代測序技術(shù)采用穩(wěn)定的可逆終止法邊合成邊測序反應,即生成新DNA互補鏈時,加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應催化底物激發(fā)出熒光,或直接加入被熒光標記的dNTP或半簡并引物,在合成或連接生成互補鏈時釋放出熒光信號;捕獲的光信號并轉(zhuǎn)化為一個測序峰值,獲得互補鏈序列信息[11]。不僅確保了測序的高精確性和高順序性,而且排除了由重復序列和同聚物導致的測序錯誤。如通過高通量測序,李曉然等[2]研究了云南地區(qū)豆豉中細菌群落多樣性,石聰?shù)萚3]對比湖南瀏陽豆豉在不同發(fā)酵階段的微生物多樣性,董蘊等[4]對湖北當陽細菌型豆豉細菌類群進行了評價。然而,作為經(jīng)典的江西特產(chǎn)中華豆豉,僅有陳廷濤、汪孟娟、楊林等[12-15]近年來結(jié)合傳統(tǒng)活菌計數(shù)、PCR-DGGE和高通量測序法對江西豆豉制曲和發(fā)酵階段的菌群動態(tài)變化進行了一定的監(jiān)測,而基于高通量測序的成品微生物群落多樣性分析卻少見報道。

本研究分別對細菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)進行PCR擴增及MiSeq高通量測序,進而分析江西特色發(fā)酵豆豉中微生物群落多樣性,從而更準確、全面地掌握其菌群特征,以了解和提高產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全性,也為后續(xù)豆豉生產(chǎn)的優(yōu)化改進提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 南昌稻香園調(diào)味食品有限公司,于實驗室-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;Phusion ? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer NEB(北京)有限公司;高效高保真酶 NEB(北京)有限公司;Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒 NEB(北京)有限公司;GeneJET 膠回收試劑盒 賽默飛世爾科技(北京)有限公司。

5427 R高速冷凍離心機、Mastercycler X50 PCR擴增儀 艾本德中國有限公司;Miseq高通量測序儀 Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 gDNA提取 采用CTAB法[2]提取豆豉樣品中所有微生物的gDNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓:100 V時間:40 min)選擇無明顯降解、無雜質(zhì),質(zhì)量合格,無菌水稀釋濃度至1 ng/μL,備用。

1.2.2 PCR擴增 以1.2.1得到的gDNA為模板,選擇Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer及高效高保真酶,采用帶Barcode的特異引物,進行PCR擴增。30 μL PCR體系:2× Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix 15 μL,2 μmol/L Primer 3 μL,1 ng/μL gDNA 10 μL,ddH2O 2 μL。PCR條件:98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30個循環(huán);72 ℃ 5 min。引物及序列信息:16S rDNA(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′),ITS1(ITS5-1737F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;ITS2-2043R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

1.2.3 擴增產(chǎn)物的混樣及純化 得到的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,根據(jù)電泳結(jié)果將PCR產(chǎn)物調(diào)節(jié)成等濃度后進行混勻,再用GeneJET膠回收試劑盒純化回收[16]。

1.2.4 高通量測序及α-多樣性分析 由北京諾禾致源科技股份有限公司測序及物種注釋、豐富度、復雜度等數(shù)據(jù)分析。采用Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫,經(jīng)定量和檢測合格后MiSeq測序。截去Barcode和引物擴增序列,FLASH拼接,過濾、去嵌合體序列,得到有效Tags。Uparse聚類OTUs,細菌采用Mothur方法與Silva數(shù)據(jù)庫(閾值設定0.8～1),真菌采用Qiime Blast方法與Unite_INSDC數(shù)據(jù)庫進行物種注釋(閾值設定0.6～1),統(tǒng)計各分類水平組成。基于物種注釋結(jié)果進行物種豐富度聚類及α-多樣性分析。以稀釋曲線、chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)評估α-多樣性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

物種注釋、豐富度等數(shù)據(jù)分析結(jié)果均采用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

經(jīng)鑒定，gDNA無明顯降解、無雜質(zhì),確認PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確,樣品合格后進行后續(xù)建庫測序分析,如圖1所示。豆豉樣品中細菌及真菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。原始上機數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾后,分別得到細菌31563條及真菌46834條有效序列;以97%的一致性經(jīng)Uparse軟件將有效序列聚類分析,分別得到細菌OTUs為114個,真菌OTUs為8個。

表1 豆豉樣品中細菌及真菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Bacterial and fungal sequencing data statistics in the Douchi

圖1 豆豉樣品中細菌及真菌PCR結(jié)果Fig.1 PCR result of bacteria and fungi in the Douchi注:M為100 bp ladder,上樣量為2 μL;1為細菌PCR產(chǎn)物, 2為真菌PCR產(chǎn)物,上樣量均為3 μL。

2.2 物種注釋

豆豉樣品中細菌物種注釋結(jié)果如圖2所示。可知豆豉樣品中細菌的組成較豐富,以占比58%的Cyanobacteria Chloroplast Unclassified(藍細菌門未分類屬)和34%的Firmicutes Bacilli(厚壁菌門芽孢桿菌綱)為主。厚壁菌門芽孢桿菌綱中,94%為Bacillales(芽孢桿菌目)和約6%的Lactobacillales(乳桿菌目)。芽孢桿菌目中以Staphylococcus(葡萄球菌屬)絕對優(yōu)勢(99%),約1%為Bacillus(芽胞桿菌屬),以及極少量的Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)。尤其值得關注的是乳桿菌目,分布較為復雜,主要為Lactobacillaceae(乳桿菌科),含51%的Lactobacillus(乳桿菌屬)和5%的Pediococcus(片球菌屬);其次為Streptococcaceae(鏈球菌科),含12%的Streptococcus(鏈球菌屬)和0.5%的Lactococcus(乳球菌屬);另有12%的Enterococcus(腸球菌屬);以及Leuconostocaceae(明串珠菌科),含7%的Leuconostoc(明串珠菌屬)和5%的Weissella(魏斯氏菌屬);0.2%的Aerococcus(氣球菌屬)。

圖2 豆豉樣品中細菌的物種注釋結(jié)果Fig.2 Species annotation result of bacteria in the Douchi

豆豉樣品中真菌物種注釋結(jié)果如圖3所示。可知豆豉樣品中真菌的組成極為單一,幾乎全為ZygomycotaLichtheimia(接合菌門橫梗霉屬)。

圖3 豆豉樣品中真菌的物種注釋結(jié)果Fig.3 Species annotation result of fungi in the Douchi

2.3 物種豐富度聚類

根據(jù)物種注釋結(jié)果,統(tǒng)計豆豉樣品的細菌、真菌在門分類水平上物種相對豐度分布,如圖4所示。可知占比最高為Cyanobacteria(藍細菌門),達58%;其次Firmicutes(厚壁菌門),為34%;分列三、四位的Actinobacteria(放線菌門)和Proteobacteria(變形菌門),各約占4%;其余6門均低于總豐度的0.1%。而豆豉樣品的真菌組成中,Zygomycota(接合菌門)占據(jù)絕對優(yōu)勢,比例高達99.94%,而Ascomycota(子囊菌門)僅為0.06%。

圖4 豆豉樣品在細菌、真菌門水平上的物種相對豐度分布Fig.4 Bacterial and fungal relative abundance on the phylum level in the Douchi

2.4 樣品復雜度(α-多樣性)分析

豆豉樣品內(nèi)細菌、真菌α-多樣性如圖5、圖6和表2所示。根據(jù)稀釋曲線、Chao1曲線、Shannon曲線結(jié)果可知,隨著測序量增加細菌和真菌均趨向平坦,說明此次實驗測序量合理,可涵蓋豆豉樣品中物種總數(shù),反映樣品內(nèi)細菌、真菌等微生物信息全貌。而且,由表2可知,豆豉樣品中細菌的物種總數(shù)(102)遠大于真菌的物種總數(shù)(8)。細菌的Shannon指數(shù)(2.106)大于真菌的Shannon指數(shù)(0.774),說明豆豉樣品中細菌的群落多樣性較真菌更高。

表2 豆豉樣品中細菌及真菌α-多樣性指標統(tǒng)計Table 2 Alpha diversity statistics of bacteria and fungi in the Douchi

圖5 豆豉樣品中細菌α-多樣性分析Fig.5 Alpha diversity analysis of bacteria in the Douchi注：A：稀釋曲線；B：Chaol指數(shù)；C:Shannon指數(shù)；圖6同。

圖6 豆豉樣品中真菌α-多樣性分析Fig.6 Alpha diversity analysis of fungi in the Douchi

3 討論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品以其獨特的風味、豐富的營養(yǎng)及優(yōu)越的益生功能等特點被人們廣泛喜愛,在很多地區(qū)已演化成寶貴的代表性文化遺產(chǎn),如紹興黃酒、鎮(zhèn)江香醋、桂林腐乳、江西豆豉、郫縣豆瓣醬、日本清酒、韓國泡菜、意大利乳酪等。基于傳統(tǒng)培養(yǎng)和分子微生態(tài)學方法,結(jié)合基因組學技術(shù),愈加證明其地域、風味特色與所處環(huán)境的特征微生物的參與密切相關[17-18]。其中豆豉作為一種我國特色的藥食兩用發(fā)酵豆制品,擁有復雜的微生物多樣性及潛在的優(yōu)良發(fā)酵益生菌株資源,近年來也愈加為科學工作者所關注[19-22]。由于多采用傳統(tǒng)工藝開放式生產(chǎn),各地區(qū)的環(huán)境氣候、原料工藝、風味偏好等差異明顯,豆豉制曲、發(fā)酵過程中及成品間的微生物種類組成差異極大,從而造就了其極具地方特色的特點。前期已有不少科研工作者采用高通量測序技術(shù)對云南[2,23-25]、湖南[3,26]、湖北[4]、甘肅[22]等國內(nèi)各地區(qū)豆豉的微生物多樣性進行了分析。然而,作為藥食兩用的地方風味特產(chǎn)江西豆豉,其微生物群落多樣性及特征卻較少被關注。少數(shù)報道也僅采用了分析能力較局限的傳統(tǒng)活菌計數(shù)和PCR-DGGE法[12-14]。在本研究中,利用MiSeq高通量測序?qū)鞫刽善分屑毦⒄婢M行了表征,并與國內(nèi)其他典型地區(qū)進行比較。結(jié)果表明,江西豆豉成品中細菌組成較為豐富,主要以藍細菌門未分類屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬為主,含少量的腸球菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬,以及極少量的乳球菌屬、氣球菌屬;而真菌組成較為單一,幾乎全為接合菌門橫梗霉屬;相比傳統(tǒng)活菌計數(shù)和PCR-DGGE結(jié)果顯然分析更為全面準確,與制曲發(fā)酵階段的菌群組成也有較大差異[1,12-15]。與其他地區(qū)豆豉樣品特征差異明顯,如云南[24,25]、甘肅[22]樣品中假絲酵母屬均為優(yōu)勢菌群,而江西未檢出;湖南瀏陽[3]樣品中雖以橫梗霉屬為主,但真菌組成更為復雜,同時存在絲衣霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛孢子菌屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬等[4]。而細菌類別中基本都存在葡萄球菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬;但比例區(qū)別較大,如云南景洪[24]樣品以明串珠菌屬為主,云南普洱[25]樣品以嗜鹽四聯(lián)球菌、湖北當陽[4]樣品以芽孢桿菌屬為絕對優(yōu)勢菌群。

4 結(jié)論

江西豆豉成品中細菌組成較為豐富,以藍細菌門未分類屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬為主;真菌組成較為單一,大都為接合菌門橫梗霉屬。因此,本研究結(jié)果進一步揭示了環(huán)境對豆豉中微生物群落多樣性的影響,同時證實了江西豆豉具有豐富的微生物群落多樣性及特色的菌群組成結(jié)構(gòu),這為后續(xù)豆豉工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)化改進提供理論指導,以進一步提高產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全性;同時也為深入挖掘具有我國傳統(tǒng)地方特色的發(fā)酵菌種和基因資源提供基礎數(shù)據(jù)和導向。